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部分、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌检验.ppt

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第四节、肉毒梭状芽孢杆菌检验一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性1、 形态与染色肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属,革兰氏染色阳性,约为 41μm的大杆菌, 多单在,偶见成双或短链,两侧平行,两端钝园,直杆状或稍弯曲,芽胞为卵圆形,大于菌体宽度,位于次极端,使菌体呈匙形或网球拍状,偶有位于中央,常见很多游离芽胞。 有 48根周生鞭毛, 运动迟缓, 无荚膜。2、培养特性?最严格的厌氧菌 ?生长最适温度 28 ℃ ~ 37 ℃ pH为 6.87.6,产毒的最适 pH为 7.8 8.2。?产毒培养温度不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。 C、 D型温度高些为宜, 35℃ 培养 3d即可,而 E型菌低温度长时间培养效果较好。?对营养要求不高 在普通培养基上都能生长。 肉毒梭状芽孢杆菌菌落 在固体培养基表面上,形成类圆形,边缘不整齐,约 3毫米左右的菌落。菌落半透明,表面一般比较光滑也有的呈颗粒状,界线不明显,向外扩散。呈绒毛网状,常常扩散成菌苔。u肉毒梭菌的生化性状很不规律,即使同型,也常见到株间的差异。3、肉毒梭菌的生化特性表 1 各型肉毒梭菌的生化反应二、 肉毒梭菌的致病性肉毒梭菌能产生 外毒素 即肉毒毒素(大分子蛋白),根据毒素的抗原特异性将其分为 A、 B、 C ( 1、 2) 、 D、 E、 F、G七个型别。与毒素型别相对应,肉毒梭菌也分为同样的七个型别。 其中 A、 B、 E、 F四型毒素对人有不同程度的致病性。A型毒素经 60℃ 2分钟加热,差不多能被完全破坏,而 B、 E二型毒素要经 70℃ 2分钟才能被破坏; C、 D二型毒素对热的抵抗更大些; C型毒素要经过 90℃ 2分钟加热才能完全破坏,不论如何,只要煮沸 1分钟或 75℃ 加热 510分钟,毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定,对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下,毒性能被胰酶激活和加强。肉毒毒素是一种神经麻痹毒素,主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱,引起肌肉松弛麻痹,特别是呼吸肌麻痹导致死亡。?? 肉毒毒素的毒性极强,是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素,据称,精制毒素 1克能杀死 400万吨小白鼠,一个人的致死量大概 1微克左右。肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多,日本以水产品较多;我国以发酵食品(如臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等)发生中毒较多。三、检验方法1、检验标准 GB 4789.12-20032、 培养基和试剂培养基庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。试剂肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶(活力 1250)、革兰氏染色液。 另需实验动物(小白鼠)。3、 检验程序 检 样毒素检测 增菌、产毒培养30℃ , 5 d报告(一) 毒素检测报告(二)分离培养培养检查毒素检测报告(三)增菌产毒培养30℃ , 5 d观察生长性状,染色镜检观察菌落性状染色镜检① 报告 一 检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。 如仅为了肉毒中毒诊断,即可结束检验 ② 报告 二 对增菌产毒培养物,一方面做生长特性观察,同时检测肉毒毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。(有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素,则应从培养着手)③ 报告 三 欲获纯菌株,可用增菌产毒培养物进行分离培养,对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测,其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。(一般情况下,没有必要从检样中分离纯的菌株,但研究或特殊需要例外)( 1)、肉毒毒素检测注射液中若有肉毒毒素存在,小白鼠一般多在注射后 24 h内发病、死亡。液态或固体样品经过适当处理后离心,取上清液实验上清液及其胰酶激活处理液分别进行小白鼠腹腔注射,各 3只,每只 0.5 mL, 观察 4 d确证试验毒力测定 定型试验 取庖肉培养基五支,煮沸 10min~ 15min, 做如下处理? 第一支 急速冷却,接种检样均质液 1 mL~ 2 mL;? 第二支 冷却至 60℃ ,接种检样,继续于 60℃ 保温 10 min, 急速冷却;? 第三支 接种检样,继续煮沸加热 10 min, 急速冷却。? 第四支 急速冷却,接种肉毒梭菌菌种。? 第五支 急速冷却,作为空白对照。以上 5支试管于 30℃ 厌氧培养 5d, 若无生长,可再培养 10d。 培养到期,若有生长,取培养液离心 , 以其上清液进行毒素检测试验,方法同上, 阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。( 2)、肉毒梭菌的检出(增菌产毒培养试验)选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物(必要时可重复一次适宜的加热处理)接种卵黄琼脂平板, 35℃ 厌氧培养 48 h。 肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时,菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样 或珍珠层样 薄层 ,但 G型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落,接种庖肉培养基,于 30℃培养 5d, 进行毒素检测及培养特性检查确证试验。(( 3)、分离培养)、分离培养( 1)毒素检测试验方法同上。( 2)培养特性检查接种卵黄琼脂平板,分成两份,分别在 35℃ 的需氧和厌氧条件下培养 48 h, 观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。
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