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活性氧代谢物衍生物和生物抗氧化能力检测方法的建立与其在评价甲状腺功能亢进疾病中的作用.pdf

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1.5.5定量检出限LoQ实验一171.5.6线性范围实验181.5.7干扰实验19】..5.8正常人参考区间实验20第二部分 生物抗氧化能力检测方法的建立及其检测性能评价212.1简介212.2试剂与仪器~212.1.1仪器212.i.2{式剂..212.1.3试剂配置222.3方法222.3.1标准品选择及配制222.3.2显色剂选择及配制232.3.3反应参数设置及优化232.3.4标本来源232.3.5不精密度实验242.3.6线性范围实验242.3.7空白限LoB实验.252.3.8检测限LoD实验.252.3。9定量限LoQ实验。252.3.10干扰实验.252.3.11.参考区间实验262.4统计学分析262.5试验结果一262.5.1方法学确立262.5.2不精密度实验272.5.3线性实验272.5.4空白限LoB实验.282.5.5检测限LoD实验..282.5.6定量限LoQ实验一292.5.7干扰实验292.5.8健康人生物参考区间实验29万方数据第三部分活性氧代谢物衍生物和生物抗氧化能力在评价甲状腺功能亢进疾病中的作用33.1研究对象..303.2仪器与材料303.2.1仪器313.2.2试剂313.3方法313.4统计学分析一323.5试验结果..32第四部分试验讨论及展望40文献综述.43氧化应激与疾病的关系.43一、ROS的稳态.44二、ROS的靶向物质.44’ 2.1蛋白质..452.DNA.z16三、ROS和疾病.473.1 ROS与心血管疾病473.2 ROS与呼吸系统疾病483.3 ROS与内分泌疾病483.4 ROS与神经系统疾病..50四、氧化应激的生物标志物.514.1脂质氧化的生物标记物..514.2蛋白质氧化的生物标志物..524.3 DNA氧化的生物标志物534.4抗氧化剂的生物标志物一54展望54参考文献.55致谢..64个人简历。65万方数据北京协和医学院硕士论文英文缩略词英文简写 英文全称 中文全称DROM derivatives of reactive oxygen metabolites 氧化代谢物衍生物BAP biological antioxidant potential 生化抗氧化能力DPD N’NDiethyl一1,4一phenylenediamine N,N.二乙基一1,4.苯二胺LoD 1imit of Detection 检测限LoB Limit of Blank 空白限LoQ Limit of Quantity 定量检出限SOD Superoxide Dismutase 超氧化物歧化酶Hb Hemoglobin 血红蛋白TBHP tert-butyl hydroperoxide 过氧化氢叔丁醇TSH Thyroid Stimulating Hormone 促甲状腺激素Fr3 Free Triiodothyronine 游离三碘甲状腺原氨酸FT4 Free Thyroxine 血清游离甲状腺素SPSS Statistic Package for Social Science 统计分析软件万方数据北京协和医学院硕士论文活性氧代谢物衍生物和生物抗氧化能力检测方法的建立及其在评价甲状腺功能亢进疾病中的作用中文摘要目的基于全自动生化分析仪,建立检测血清中氧化代谢物衍生物Derivatives ofReactive Oxygen Metabolites,DROM和生物抗氧化能力Biological AntioxidantPotential,BAP的检测方法,并对其检测性能进行评估,建立健康人参考区间。比较健康对照与甲状腺功能亢进患者血清DROM和BAP水平差异,通过研究DROM和BAP水平与甲状腺功能亢进疾病之间的相关性,探究氧化应激指标DROM和还原指标BAP在评价甲亢中的作用方法根据DROM和BAP的检测原理,建立可应用于全自动生化分析仪的氧化还原体系血清学指标。参考美国国家临床和实验室标准协会Clinical and LaboratoryStandards Insitute,CLSIEPl5一A2、EPl7.A、EP6.A、EP7。P方案对该方法的精密度、空A 5PcLoB、检出限LoD、定量检出限LoQ、线性范围、干扰因素进行评估,以此分析新建立的DROM和BAP检测方法的检测性能。分别选取健康非吸烟成年人300例和287例进行DROM和BAP检测,建立正常人参考区间。2014年11月1日至2015年3月31日于卫生部北京医院门诊治疗的甲状腺亢进患者73例,选取年龄性别匹配的健康人100例。所有受试者都进行了DROM、BAP、SOD氧化应激相关指标的检测以及TSH、FT3、FT4甲状腺相关激素的检测。结果1DROM批内不精密度为2.38%一3.85%,总不精密度为4.33%一6.67%;空白限LoB为2.85mmol/L过氧化氢叔丁醇,检出限LoD为11.43mmol/L过氧化氢叔丁醇,定量检出限LoQ为26.88mmol/L过氧化氢叔丁醇;线性范围为万方数据北京协和医学院硕士论文31.77.400.00mmol/Lra0.995;三种干扰物在试验浓度内甘油三脂旦7.18mmol/L,Hb_一mmol/L TBHP.When hemoglobin--.1 759/L,triglyceride一27.1 8mmol/Land Vice60 I-tmol/L,the deviation was 47.3%,5.62%and 14.89%respectively.2.The target low and high concentration vitamin C solution test results show that,the total imprecision is5.87%the low and high flesh serum specimen test resultsshow that the total imprecision is1 4.1 4%.The blank limit is 0.068 mmol/L;detection limit for flesh serum specimen is 0.1 54 mmol/L;quantitative limit for serumspecimen is O。224 mmol/L.Vitamin C concentration in the 0-4 mmol/L range.the testresults are linearR20.9996.The normal reference interval was≥2.89 mmol/L VitC.When hemoglobin一1709/L,triglyceride一7.385mmol/L and bilirubin一73.8 gmol/L,the deviation was一2.58%.-13.1 1%and 83.1%respectively.3.Serum levels of SOD are positively associated with TSH r0.264,P0.024,meanwhile the levels of SOD are negatively associated with FT3r一0.250,P0.035.There is no significant correlation between the levels of DROM with TSHr-0.087,P0.464,FT3r0.201,P0.092,FT4r0.072,P0.548.There isno significant correlation between the levels of BAP with TSHrO.1 93,P0.101,FT3r-0.101,P0.403,FT4r一0.095,P0.425.ConclusionResults of DROM and BAP study show that the precision,the detection limit andthe linear range of DROM and BAP using automatic biochemical analyzer cancomply with the requirements of the clinical laboratory.Levels of DROM are increased in the serum of patients with hyperthyroidismcompared with contr01.Serum levels of BAP and SOD are decreased.The level of5万方数据北京协和医学院硕士论文SOD is positively correlated with the level of TSH and negatively correlated with thelevel ofFT3.Keywordsoxidative stress;reactive oxygen metabolites;biological antioxidantpotential tests;hyperthyroidism6万方数据北京协和医学院硕士论文前言氧化应激Oxidative Stress,OS是指细胞、组织或机体内氧化压力过高的一种状态,常源于自由基的累积,或抗氧化水平的下降。生理情况下,自由基、活性氧等随衰老而累积,抗氧化水平包括抗氧化剂与抗氧化酶随衰老而下降,当体内高活性分子如活性氧簇reactive oxygen species,ROS矛N活性氮簇reactivenitrogen species,RNS产生过多,超出人体的清除能力,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。1956年Denham HarmanⅢ首次提出自由基衰老学说The”free.radical theory”of ageing,该学说认为内源性的自由基是在细胞内产生的,攻击生命大分子造成组织细胞损伤,这是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。随后Gerschman,Fenn眩1和Gerschman∞,划也进一步证实了自由基对我们人体是有害的。氧化应激被证实与许多疾病有关联如动脉粥样硬化嘲,帕金森病‘6|,衰老Ⅲ,癌症嘲,呼吸肌功能障碍‘9|,慢性阻塞性肺病n 0|,糖尿病n。他3,风湿性关节炎n卜151,骨质疏松n6’171等。自由基的化学性质非常活泼,很容易与其他物质发生化学反应,因此直接测定体内自由基水平极为困难。目前临床上通过检测自由基的氧化代谢产物如丙二醛、8一异前列腺素、抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶及非酶抗氧化剂如谷胱甘肽、维生素C、维生素E、尿酸、胆红素、铜蓝蛋白评价机体氧化应激水平。然而,单独测定某一种或某些自由基氧化代谢产物的含量往往不能全面反映机体的氧化负荷,且操作上较为困难和繁琐。国外有学者提出了一种新的氧化应激评价方法一一活性氧代谢物衍生物derivatives of reactive oxygen metabolites,DROM检测[18,19】和生物抗氧化能力biological antioxidant potential tests,BAP检测【201。DROM检测是通过对血液中总的活性氧代谢产物含量测定以评价人体内整体氧化应激水平的一种方法。DROM的主要成分为氢过氧化物ROOH,氢过氧化物是脂质、多肽、氨基酸等被自由基氧化的中间产物。与丙二醛、8.异前列腺素等单独测定某一自由基氧化代谢产物相比,DROM测定结果可以反映体万方数据北京协和医学院硕士论文内总的自由基氧化代谢产物含量,进而评价总体氧化应激水平,更全面地反映机体的氧化负荷。而BAP则是通过检测总体的抗氧化能力,来全面反映机体氧化应激水平。目前,国际上针对DROM和BAP的氧化应激分析评估系统通常包括检测试剂、参考品标准品、质控品、分光光度仪整套系统,需手工操作,操作过程相对复杂、成本花费较高。至今为止,国内市场上尚缺乏公众认可的检测DROM和BAP的产品。甲状腺功能亢进症简称甲亢是一种常见的,由多种病因导致甲状腺功能增强,以甲状腺产生和分泌过量的游离T3或T4为特征的临床综合征,其主要的临床表现是神经过敏、烦躁失眠、心悸、心动过速、怕热、多汗、体重减轻、食欲亢进等等,主要分为四大类临床表现甲状腺肿大,眼征,基础代谢增加和自主神经系统功能失常。各种病因所导致的甲亢中,以格雷夫斯氏病为最常见的病因。甲亢疾病以女性多见,男女发病比例为l4~6,以20~40岁多见。多数起病缓慢,少数在精神创伤或感染等应急后急性起病。典型表现有甲状腺激素分泌过多所导致的高代谢症候群、甲状腺肿大以及眼征。确诊主要依据甲状腺激素测定,促甲状腺激素Thyroid Stimulating Hormone,TSH降低、甲状腺激素水平升高。机体中的ROS主要来源于腺嘌呤核苷三磷酸Adenosine Triphosphate,ATP的合成,细胞中ROS的水平直接受细胞呼吸频率的影响。正常生理状态下,多重的抗氧化机制限制着ROS的扩散及其对细胞内器官的影响,一旦氧化应激平衡被打破的时候,氧化损伤就会表现出来。甲状腺激素作为人体内控制代谢和呼吸频率的主要激素,其与氧化应激损伤的关联不仅表现在其对于代谢功能的增强上,也表现在他们对于抗氧化系统的影响[21,221。因此,我们猜测甲状腺功能亢进所显示氧化应激失衡状态有可能会表现在血清标志物上。本研究试图建立操作简单、成本低廉、性能可靠的DROM和BAP检测方法,适用于临床实验室普遍使用的全自动生化分析仪,并得到健康人参考区间。通过比较正常人与甲状腺功能亢进患者DROM和BAP水平差异,研究DROM和BAP水平与甲状腺功能亢进患者疾病严重程度的相关性,探究氧化应激指标DROM和BAP在评价甲亢患者中的作用。万方数据
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