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鸡蛋中四类兽药的高效液相色谱残留检测方法分析.pdf

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摘要本研究建立了鸡蛋中喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类、四环素类的药物残留分析方法。采用简单的传统液液萃取结合固相萃取的方法将鸡蛋样品提取、净化后,经高效液相色谱仪分析,测定了鸡蛋中四类兽药的残留,试验结果如下1.鸡蛋中喹诺酮类药物残留分析方法的研究建立了鸡蛋中4种喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱法。样品采用磷酸盐提取液提取,正己烷除脂,过PLS柱净化,供高效液相色谱分析测定。结果显示,4种喹诺酮类药物在50 ng儋~1000 n∥g浓度范围内呈现良好的线性相关,检出限和定量限分别为10 ng儋和50 n∥g,在10 n∥g、200 n∥g、500 n∥g三个添加浓度回收率为60.2%~68.2%,日内、日间相对标准偏差均小于6.6%。2.鸡蛋中磺胺类药物残留分析方法的研究建立了鸡蛋中6种磺胺类药物残留检测的高效液相色谱法。提取溶剂为乙酸乙酯,结合超声波辅助提取,真空旋转蒸发后,用流动相溶解残留物,过OaLsis MCx固相萃取柱,5%氨化甲醇洗脱,选用C18反相色谱柱进行高效液相色谱分析测定。在选定的色谱条件下,6种磺胺类药物在15 n∥g~1000 n∥g浓度范围内呈现良好的线性相关,检出限为5 I∥昏10 n∥g,定量限为15 n∥g、30 n∥g,在10 ng侄、200 n∥g、500 n∥g三个添加浓度回收率为70.1%~82.5%,日内、日问相对标准偏差均小于5.5%。3.鸡蛋中酰胺醇类药物残留分析方法的研究建立了鸡蛋中2种酰胺醇类药物残留检测的高效液相色谱法。样品采用8515乙腈一水溶液提取,正己烷除脂后,再加入乙酸乙酯,真空减压蒸干后,用595乙腈一水溶液溶解残留物,过C18固相萃取柱,供高效液相色谱测定。研究结果显示,2种酰胺醇类药物在50 n∥g~1000 n∥g浓度范围内呈现良好的线性相关,检出限与定量限分别为10 ng儋和50 ng儋,在10 n∥g、200 ng儋、500 n∥g三个添加浓度回收率为60.6%~71.1%,日内、日问相对标准偏差小于6.5%。4.鸡蛋中四环素类药物残留分析方法的研究建立了鸡蛋中4种四环素类药物残留检测的高效液相色谱法。采用Na2EDTA.Mcllvaine溶液为提取溶剂,PLS囤相萃取柱净化,草酸甲醇洗脱,35℃水浴氮气浓缩并定容后,高效液相色谱测定。结果显示,4种四环素类药物在30 n∥g~1000 n∥g浓度范围内线性关系良好,检出限为10 ng/g,定量限为30 ng/g、50 n∥g,在10 n∥卧200 n∥g、500 n∥g三个添加浓度回收率为61.5%~74.4%,日内、日间相对标准偏差小于5.6%。本论文开展了鸡蛋中4类兽药残留分析方法的研究。根据药物的理化特性和鸡蛋基质的特点,优化了各类药物残留检测的样品前处理方法与色谱条件参数,在准确度、灵敏度、特异性、可操作性等方面均获得J,较好的效果,能够满足鸡蛋中4类药物残留的检测的相关要求。万方数据关键词鸡蛋;兽药残留;高效液相色谱法;喹诺酮类药物;磺胺类药物酰胺醇类药物;四环素类药物万方数据study on detection of fbur Veterinary drug residues in eggsby high perf.ormance Iiquid chromatOgraphyCandidateY抽g NaIlaM旬orBaSic veterina巧MedicineA“isorsLiu JuXjangAbstract7rKs study establiShed residue a11alytical s of quinolones,sulfon锄ides锄phemcols,t咖cycliIles linds of dmgs in eggs.Using me simple订aditiollal liquid-1iquidextllaction metIlod combined丽m the solid-phase memod to extract a11d Durif5,eggss锄ples,弛ally using high perfomaIlce liquid chromatography to analysis.Four lindsofveterinary drug residues in eggs were detennined,results are as f0110ws1.Rese疵h of aIlalysis on quinolones residue i11 EggsThe fbur kinds of quinolones residues dete肌ination of eggs by HPLC wasesta_blished.S锄D1es were ex仃acted by phosphate,wiped og f.at by n-hexalle孤d wento、,er PLS cartridge puri母for HPLC detennination.111e resuhs sho、ved tllat four kinds ofquinolones showed good line撕ty ill a姗ge of 50 ng/g1 ooO ng僖111e limits of detectionwere 1 O n眈and恤limit of qu枷fication werle 50 n∥g.RecoVeries啪ged丹om 60.2%to 68.2%for the廿u七e di妇Ferem concentrations added10 n∥g,200 n∥g,500 ng儋.In虹a-dav a11d Inter-dav relative staIldard deViations、vere less廿1an 6.6%.2.Research of a11alysis on sulfon锄ides residue in eggsThe siX bnds of sulfon锄ides residues detennination of eggs by HPLC、Ⅳasest£lblished.The extraction s01ventⅥ,as etllvl acetate,combined witll ultrasonic assistedex仃action,t11en waS vacu啪evaporated.The residue dissolved in mobile phaSe,aIld wentover t}le Oasis MCX solid phaSe extraction car仃idge.5%舭肌oniation of methanol、vasused to purge.Then C l 8 reverse c01umn waS chosen to HPLC a11alysis.Under the selectedchronlatographic conditions,six kinds of sulf.onamides sho、ved good 1inearity in a mnge of1 5 n∥gl 000 n∥g.The limits of detection were 5 ng/g and 1 0 n∥g a11d the limit ofquamification were 15 ng/g and 30 ng/g.Recoveries raJlged f-rom 70.1%to 82.5%for thetllree di航rent concentr瞰ions added1 0 n∥g,200 I拶g,500ng儋.Intra·day a11d Inter-d埘relative st乏mdard deviations were less than 5.5%.3.Research of a11alvsis on amphenicols residue in e29sThe of HPLC for detennination of two kinds of amphenicols residues in eggswas developed.S锄ples were extracted with acetonit“le.water851 5.The fat was wipedo仃bv n.hexane a11d men ethvl acetate was added.The liquid was vacumn evaporated underreduced pressure.The residue was diss01ved in acetonit“1e.waterf595,and、vent overC 1 8 solid Dhase extraction columns for HPLC dete珊ination.The results showed that twokinds of锄phenicols showed good lineaLr coHelated in the concentration range of 5 0n∥g~l 000 n∥g.The limits of detection were 1 0 ng/g and the limit of quantincation were50 n∥g.Two kiIlds of锄phenicols at 1 0 n∥g,200 n∥g,500 n∥g tllree concentrationadded the average recoverV rate ranged from 60.6%to 7 1.1%.Intra-day aJld Interday万方数据relative standa帕deviations were less tllan 6.5%.4.Research of aIlalysis on temlcyclines residue in eggsThe me廿10d of HPLC for detemlination of four虹nds of tetracyclines residues in eggswaS developed.The ex仃action solvem was Na2EDl、A.Mcllvaine solution,purmcation ofPLS solid Dhase ex仃action collmln.0 xalic acid methanol was used to elu旧on.ThenⅡ1es锄Dles were concentr劬ed by 35℃ water bathed and constant volume for HPLCdete眦ination.The m酬№d of fbur k访ds of te仃acyclines showed good 1inear correlated in也e concentration mge of 30 ng儋~1000 n∥g.The 1imits of detection、骶10 n∥g,thelimits of quantification were 30 n∥g and 50 n∥g.Four kinds of tetracyclines at 1 0 ng但,200 n∥g,500 ng儋Ⅱlree concer衄ation缸lded t11e aVerage recoVer,rate ranged from 6 1.5%to 74.4%,【I】tra.day a11d Inter-day relative standard deviation were 1ess than 5.6%.TIlis paper stlldied on the aIlalysis of 4虹nds of veterinary dmg residues ineggs.According to廿le ch锄ical properties of drugs aIld the characteristics of也e eggmatrix,optimization t11e detection of dmg residues iIl s锄ples of various t,pes ofpre-treatment metllods aJld clmom酏。铲印拭c conditions par锄eters.Accuracy,sensitivi吼specmci劬operabili吼etc、Ⅳere obtained satisfacto巧results,which call meet 4 d11lgresidues testing requirements in eggs.Key wordseggs;Veterin乏Ⅱy dmg residues;hi曲perfb姗ance liquid chromatography;quinolonessulfbn锄ides;锄phe芏licols;tetracyclines万方数据ENRCIPLOMNORSDSM2SⅣfPSMMSMZSDMCAPFFoTCTCCTCDOTCHPLCGC/MSLCMSLODLOQRSDEnronoxacinClpmnoxacinLomenoxacinNorfloxac.nSulphadiazine缩略词SulfadimidineSul伽nemoxypyridazineSulfamonomemoxineSul鼬ethoxazoleSult.adimemOⅪneChlor枷phenicolFlorfenicol0 x”etracyclineTen.acyclineChlorote仃acyclineDoXycyclineHigh perf0Hnance liquid chmmatogmphyjas chmmato掣印hy/maSs spectrome廿yLiquid chromatography/maSs spectrometqLimit of detectionLimit of quantitatiOnRelative standard deviation恩诺沙星环丙沙星洛美沙星诺氟沙星磺胺嘧啶磺胺二甲嘧啶磺胺甲氧哒嗪磺胺间甲氧嘧啶磺胺甲嗯唑磺胺地索辛氯霉素氟苯尼考土霉素四环素金霉素多西环素高效液相色谱气相色谱质谱联用液相色谱质谱联用检测限定量限相对标准偏差万方数据目录l;l言l1.1喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类、四环素类药物概述一l1.1.1喹诺酮类药物l1.1.2磺胺类药物11.1.3酰胺醇类药物21.1.4四环素类药物21.2兽药残留对人体的危害..21.2.1喹诺酮类兽药残留危害21.2.2磺胺类兽药残留危害31.2.3酰胺醇类兽药残留危害31.2.4四环素类兽药残留危害41.3鸡蛋中兽药残留形成主要原因..41.3.1不执行休药期规定41.3.2非法使用违禁药物41.3.3兽药使用不规范、不科学51.4喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类、四环素类兽药残留检测方法..51.4.1气相色谱法51.4.2高效液相色谱法51.4.3气相色谱.质谱联用法一61.4.4高效液相.质谱联用法..61.4.5高效毛细管电泳法71.4.6免疫分析技术81.4.7微生物抑制分析法81.5研究背景和意义..92鸡蛋中喹诺酮类药物残留分析方法的研究102.1材料方法102.1.1主要仪器.102.1.2试剂和药品.102.1.3溶液配制.102.1.4色谱条件.112.1.5组织样品的提取与净化.112.1.6方法学考察.112.1.7鸡蛋中ONs残留状况调查122.2结果。122_2.1方法学特异性.1 22.2.2线性范围、检出限和定量限.142.2.3精密度、准确度和回收率.142.2.4稳定性试验结果.1 52.2.5 QNs兽药残留检出率和超标率.152.3讨论..15万方数据2.3.1样品前处理方法的优化.152.3.2色谱条件的优化163鸡蛋中磺胺类药物残留分析方法的研究173.1材料方法173.1.1主要仪器.173.1.2试剂和药品173.1.3溶液配制173.1.4色谱条件183.1.5样品前处理方法.183.1.6方法学考察1 83.1.7鸡蛋中SAs残留状况调查193.2结果.203.2.1色谱分离与测定203.2.2线性范围、检出限和定量限.2l3.2.3精密度、准确度和回收率.213.2.4稳定性试验结果223.2.5 SAs兽药残留检出率和超标率.223.3.讨论.233.3.1样品前处理条件的优化.233.3.2色谱条件的优化.244酰胺醇类药物残留分析方法的研究..254.1材料方法254.1.1主要仪器254.1.2试剂和药品254.1.3溶液的配置254.1.4色谱条件264.1.5组织样品的提取与净化.264.1.6方法学考察264.1.6.1方法学特异性.264.1.7鸡蛋中酰胺醇类药物残留状况调查.274.2结果.274.2.1方法学特异性274.2.2线性范围、检出限和定量限.294.2.3精密度、准确度和回收率.294.2.4稳定性试验结果一294.2.5酰胺醇类兽药残留检出率和超标率294.3讨论.304.3.1色谱条件的优化304-3.2样品前处理条件的优化305鸡蛋中四环素类药物残留分析方法的研究325.1材料方法..325.1.1主要仪器.325.1.2试剂和药品325.1-3溶液配制33万方数据5.1.4色谱条件.335.1.5组织样品的提取与净化.345.1.6方法学考察.345.1.7鸡蛋中TCs残留状况调查355.2结果.355.2.1方法学特异性与专一性.355.2.2线性范围、检出限和定量限.365.2.3精密度、准确度、回收率.375.2.4稳定性试验结果.375.2.5 Tcs兽药残留检出率和超标率..375.;讨论..385.3.1样品前处理条件的优化.385.3.2色谱条件的优化一386结论.40参考文献..4l攻读学位论文期间发表论文情况..47作者简介..48致谢49万方数据鸡蛋中四类兽药的高效液相色谱残留检测方法研究l引言1.1喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类、四环素类药物概述1.1.1喹诺酮类药物喹诺酮类药物QNs基本结构包括喹琳等母核,3位的羧基和4位的酮基,根据其7位的取代基是否含有呈碱性的哌嗪环可以将该类药物分为酸性喹诺酮和哌嗪喹诺酮ll。2J。通常于室温条件下贮存药物相对稳定,但光照下易分解且分解产物具有毒性,其分子结构中的酮羰基和羧基极易与金属离子结合而形成螫合物13J。0Ns药物的抗菌作用通过选择性抑制细菌DNA中的拓扑异构酶IV及螺旋酶而表现出来。细菌DNA的复制、转录等过程需要细菌DNA螺旋酶的参与,而拓扑异构酶Iv则在细菌细胞壁的分裂过程中对细菌染色体起关键作用,QNs能够抑制上述两种酶,可协同使细菌的复制受刚41。QNs药物抗菌谱较广,特别对需氧革兰阴性杆菌包括军团菌、铜绿假单胞菌在内均有良好的抑菌作用,对产酶金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌也有良好的抗菌作用;口服吸收好,血浆蛋白结合率相对较低,组织穿透力强,血浆半衰期较长,部分药物经肝脏代谢,部分以原形通过尿液排出;适用于敏感病原菌如肺炎球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、弯曲菌属和淋病奈氏菌、肠道革兰阴性杆菌等所致的尿道感染、胃肠道感染、呼吸道感染以及关节、皮肤、软组织感染等都有很好的治疗效果。QNs药物为化学合成药,价格低廉,在多学科领域特别是在兽医行业早已广泛应用,并且有关临床应用和新的衍生物开发研究仍在不断地发展进步中,用药目的也由最初的治疗尿路感染,发展到现在的用于治疗系统感染性疾病,并且在畜牧业生产中作为预防及治疗药物广泛使用p制。近年来常用的QNs主要有ENR、CIP、LOM、NOR等。1.1.2磺胺类药物磺胺类药物SAs为人工合成的一类具有对氨基苯磺酰胺母核结构的抗菌药物的总称17剖,分子中含有氨基、苯环和磺酰胺基,通过阻止细菌酶系统对对氨基苯甲酸的利用,而影响细菌细胞核蛋白的合成,使细菌的生长和繁殖受到抑制。SAs敏感菌在其生长繁殖过程中通常不能直接利用其生长环境中的外源叶酸,而是以喋啶和对氨基苯甲酸为原料,在二氢叶酸合成酶的催化作用下合成二氢叶酸。二氢叶酸通过二氢叶酸还原酶的作用被还原形成四氢叶酸,四氢叶酸为一碳单位转移酶的辅酶,能够参与核酸的合成。SAs的化学结构同对氨苯甲酸类似,可与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,妨碍二氢叶酸的合成,结果使细菌生长、繁殖受到抑制。该类药物一般呈白色至微黄色的结晶性粉末,味微苦,无臭,光照下易分解变质,药物颜色表现为逐渐加深。水中药物溶解度极低,但形成钠盐后则易溶于水,水溶液呈强碱性,较易溶于稀碱。sAs在体内通过氧化、乙酰化、羟基化三种途径完成代谢过程。SAs抗菌谱广,对多数革兰阳性菌和部分革兰阴性菌、某些原虫等如阿米巴原虫、疟原虫等、衣原体属、诺卡氏菌属均有良好的抑制作用。在畜牧业生产过程中可用于治疗和预防某些动物疾病,如家禽霍乱、白痢、传染性鼻炎、伤寒等万方数据河北农业大学硕士学位毕业论文疾病水产业中,可用来控制肠毒败血症和大肠杆菌病等。此外,农业生产过程经常以亚治疗浓度的SAs药物作为饲料添加剂以降低疾病的发生概率,促进经济动物生长,提高动物抗病能力,进而提高畜禽产量19】a近年来,常用的SAs主要有sD、SM2、sMP、sMM、sMz、sDM等。1.1.3酰胺醇类药物酰胺醇类药物属广谱抗生素,主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等,该类药物通过可逆性地与70S核蛋白体50S亚基上的A位结合,阻断转肽酰酶催化转肽反应,从而使新肽链形成受阻,细菌蛋白质的合成受到抑制。通常为白色至微带黄绿色的结晶性粉末,无臭,微溶于水,易溶于甲醇,几乎不溶于乙醚和氯仿。对化脓性链球菌、肺炎链球菌、淋球菌、绿色链球菌、脑膜炎球菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、白喉杆菌、棒状杆菌、立克次体、衣原体、钩端螺旋体和一些厌氧菌均有良好的抑菌作用。养殖业中酰胺醇类药物通常被用来治疗气喘病、传染性胸膜性肺炎、萎缩性鼻炎、猪肺疫、链球菌病等、猪黄白痢、肠炎、血痢、霍乱、雏鸡白痢、传染性鼻炎气囊炎等。氯霉素曾在人医I临床和畜牧兽医行业广泛使用,但随后发现该药可抑制人和动物骨髓造血功能,引起再生障碍性贫血等副作用而被世界各国明令禁止使用,目前,氟苯尼考作为氯霉素的替代品的动物专属性药物早己广泛应用于食用性动物的养殖中【n¨】。1.1.4四环素类药物四环素类药物TCs是一类由链霉菌产生以多环并四苯羧基酰胺为母核的衍生物【l 21,通过干扰细菌蛋白质的合成而发挥抗菌作用。药物进入菌体后,能够可逆性的与细菌核糖体上的30S亚基结合,干扰tRNA同mRNA.核糖体复合物上的受体相结合,阻断肽链的延长,从而抑制蛋白质的合成,最终使细菌的生长繁殖受到抑制。1℃s大多呈淡黄色至暗黄色的结晶性粉末,‘味苦,相对易溶于水与乙醇、在非极性有机溶剂不溶,属于酸碱两性化合物,在弱酸性环境中相对稳定,在酸性pHQ、中性、碱性溶液中均易发生降解而造成失效。干燥条件下稳定,但容易吸水、在光照下颜色变暗,需避光干燥处保存。TCs可与金属离子形成螫合物,螯合物的形成取决于pH值【l引。该类药物对革兰氏阳性菌和阴性菌、原虫、支原体、螺旋体、立克次体、衣原体等均有良好的抑制作用【I 4。,因而被称为广谱抗生索。TCs因其广谱的抗菌活性和药动学特征而在禽畜养殖中应用广泛,常用于治疗畜禽白痢、牛出血性败血症、猪肺疫、牛肺炎、禽霍乱、鸡慢性呼吸道病、猪气喘病、泰勒虫病、放线菌病、子宫蓄脓、子宫内膜炎等疾病,同时被作为饲料添加剂应用于提高畜禽生长速度和饲料转化率等方面I”】。近年来,常用的Tcs主要有oTc、Tc、CTC、DOTC等。1.2兽药残留对人体的危害动物性食品中兽药残留水平虽然较低,但若长期食用含有兽药残留超标的食品,如同长期、广泛被动使用这些药物,这势必会对人们的身体健康造成严重的负面影响,其危害主要表现在急性或慢性中毒反应、“三致”作用、过敏反应、引起细菌耐药性、遗传毒性、免疫危害等方面。1.2.1喹诺酮类兽药残留危害2万方数据
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