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家蚕和果蝇的抗菌肽Cecropin+B基因的表达及产物抑菌活性分析.pdf

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安徽农业大学硕士学位论文家蚕和果蝇的抗菌肽Cecropin B基因的表达及产物抑菌活性分析姓名杨莹申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师徐家萍2011-06摘 要 抗菌肽 Cecropin B 是一种线性多肽,分子量约为 4kD,在疏水环境中易形成两亲性Amphipathicα -螺旋,具有热稳定性,水溶性好。Cecropin B 具有抗细菌、抗真菌等作用,近年来发现还有抗肿瘤及抗艾滋病病毒的活性,引起了国内外研究者的广泛关注。从生物组织中分离获得大量抗菌肽难度大,人工合成成本高,因此利用基因工程的方法表达抗菌肽成为近年来的研究热点之一。 本研究构建了原核和真核表达载体,在大肠杆菌中表达家蚕( Bombyx mori)和果蝇( Drosophila melanogaster)抗菌肽 Cecropin B2,并比较了两种抗菌肽的活性。同时也在昆虫杆状病毒体系中表达了家蚕( Bombyx mori)抗菌肽 Cecropin B2。获得以下主要结果 1.根据大肠杆菌基因翻译偏爱的密码子,分别对其进行优化后,并用 overlap extension PCR 的方法扩增获得了家蚕和果蝇抗菌肽基因 BmCecB2 和 DmCecB2,将人工合成的 PCR 产物与表达载体 pET32a 重组,构建了表达载体 pET-32a-BmCecB 和pET-32a-DmCec B,转化 E.coli BL21DE3, IPTG 诱导表达。 表达产物经 SDS-PAGE电泳和 Western blotting 检测,在预期的相应位置出现了特异的蛋白条带,表明Cecropin B 基因在 E.coli BL21DE3宿主菌中获得成功表达。分离纯化融合蛋白后,用肠激酶将 N 端的融合部分切除,得到完整抗菌肽,通过沸水煮过后,抑菌实验结果显示,表达的 Cecropin B 蛋白具有抑菌活性。 BmCecB2 和 DmCecB2 表达产物的抗菌活性存在明显差异 DmCecb2 和 BmCecb2 表达产物的质量浓度为 10 mg/mL 时,其对大肠杆菌(E. coli ) DH5 α 的抑菌圈直径分别为 15 和 8 mm 左右,最小抑菌浓度分别为 0.05、 0.1 mg/mL。结果说明 DmCecb2 的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于 BmCecb2。 2.采取 Bac-to-Bac 表达系统将抗菌肽 Cecropin B 基因在昆虫细胞中表达,,该系统具有高效表达、无内毒素污染、翻译后修 饰等优势。将家蚕抗菌肽 Cecropin B基因及连接荧光标记基因的 Cecropin B 分别克隆至杆状病毒转移载体 pFastBacI,构建的重组质粒 pFastBacI-BmcecB 和 pFastBacI-BmcecB-EGFP 分别转化大肠杆菌DH10Bac 感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒 Bacmid-BmcecB 和 Bacmid-BmcecB- EGFP。两种杆粒 DNA 在脂质体 Lipofectin 介导下侵染家蚕细胞,获得含 BmcecB 基因的重组杆状病毒,重组病毒感染 Bm 细胞后,表达目的蛋白。在荧光显微镜下,可以看到转基因阳性细胞带有绿色荧光。超声裂 解细胞,抑菌试验结果显示,表达的IBmcecB 蛋白具有抑菌活性。为今后进一步的实验研究提供依据。 关键词家蚕,果蝇,抗菌肽 Cecropin B2,原核表达,抑菌活性,杆状病毒表达系统,基因结构 IIAbstract Cecropin B is a small protein with a molecular weight of about 4kD, and it is a water-soluble and heat-stable peptide, which is easy ed in amphipathic α-helix. Cecropin B has many important functions, such as antibacterial and antifungal activities. Recently, it has also been found to have antitumoural activity and restrain HIV. These functions have made people more interest, because it is difficult to obtain purified antibacterial peptide from biotic tissues in large quantity, and the cost of chemical synthesis is high. This study constructs prokaryotic expression vector and eukaryotic expression vector. First, tow kinds of cecropin B2 between Bombyx mori and Drosophila melanogaster were expressed in E. coli. Also have expressed Bombyx mori Cecropin B2 in insect baculovirus system . The results obtained are as follows 1. According to E. coli gene’s translation of anticodon preference, we synthetic Bombyx mori cecropin B CecB2 and Drosophila melanogaster cecropin B CecB2, through the of overlapping PCR,and optimize them respectively .Tow kinds of cecropin B2 were recombined with pET32a to construct expression vector pET32a-BmCe- cBand pET32a-DmCecB. Then two vector were expressed in E. coli BL21DE3 after induction with IPTG respectively. them product were measured by SDS-PAGE and Western blotting. The expected specific band indicated that the expression of cecropin B gene in E. coli BL21DE3 was successful. After the separation and purification of the fusion protein, the His Tag was excised from product in its N termination by enterokinase. Integrated antibacterial peptide was obtained. Antimicobial activity analysis results showed that the two products could restrain E.coli DH5α after treated with boiling water, and the antibacterial activity were significantly different between DmCecb2 and BmCecb2. While the concentration of the two proteins is both 10 mg/ml, the diameters of bacteriostasis circles were 15 and 8mm, respectively. The minimum inhibiting concentrations were 0.05 and 0.1 mg/ml, respectively. These results suggested that prokaryotic expression efficiency and antibacterial activity of DmCecb2 were higher than that of BmCecb2. 2. Through Bac-to- Bac system, antibacterial peptide genes Bombyx mori cecropin B CecB2 was expressed in insect baculovirus expression vector system, because of its advantages such as high-level expression, endotoxin-free, post-translational modifications IIIand so on. BmCecB and BmCecB-EGFP were cloned into baculovirus transfer vector pFastBacI respectively. Two recombinant plasmid pFastBacI-cecB and pFastBacI-cecB-E- GFP were transferred to E.coli competent cells DH10Bac. The recombinant bacmids Bacmid-cecB and Bacmid-cecB-EGFP were obtained. Both bacmid DNA were transfected into silkworm cells mediated by lipofection. The recombinant baculovirus was obtained and transfected into silkworm cells to express. In fluorescence microscopy, green fluorescent transgenic positive cells were observed. Subsequently, the cells were broken by ultrasonic, the results of antimicobial activity showed that of BmCecB has significant antibacterial activity. The results of our study can be used as the basis of the further research. Key words Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Cecropin B2, Prokaryotic expression, Antibacterial activity, Baculovirus expression vector system, Gene structure IVVII缩写与符号 BEVS 杆状病毒表达系统 ORF 开放读码框 Bm Bombyx mori 家蚕 DmDrosophila melanogaster 果蝇 BmNPV 家蚕核型多角体病毒 RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链式反应 GFP 绿色荧光蛋白 FBS 胎牛血清 SDSSodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 PBS 磷酸盐缓冲液 IPTG 异丙基硫代- β-D-半乳糖苷 X-gal 5-溴-4- 氯 -吲哚- β-D-半乳糖苷 Agarose 琼脂糖 Amp 氨卞青霉素 Kanamycin 卡那霉素 EB 溴化乙锭 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DTT 二硫苏糖醇 APS 过硫酸铵 TEMED N,N ’- 四甲基乙二胺 EDTA 乙二胺乙酸 文献综述 1 抗菌肽简介及研究进展 1.1 抗菌肽简介 抗菌肽antibacterial peptide , ABP是生物体内具有免疫屏障作用的一类多肽,是天然免疫系统中不可缺少的重要组成部分[1] 。自 20 世纪 70 年代末 Boman 等[2]首次在惜古比天蚕(Hyalopbora cecropia )中诱导发现天蚕抗菌肽天蚕素(cecropin )以来,迄今已有 1 000 多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定,且来源于昆虫的抗菌肽就有200 多种。 1.1.1 抗菌肽的分类 根据抗菌肽的结构,可将其分为 5 类[3]。 (1)具有螺旋结构的线性多肽,该类多肽抗生素分子量一般在 4KDa 左右,不含半胱氨酸,但能形成两个两性 α 螺旋,可形成近乎完美的双亲螺旋结构,多数多肽的C 端被酰胺化,酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。此类抗菌肽首先发现于昆虫体内, 以 由 惜 古 比 天 蚕 Hyalopora cecropia 中鉴定的 cecropinA-F 为典型代表[4]。 Lee等人从猪小肠中分高到了 cecropin P1,说明了 cecropins 可能在动物中也广泛存在。 此外, magainins 也是较早发现的一类具有双亲螺旋结构的抗菌肽。 ( 2)富含某种氨基酸的线性多肽,如 Pro,Trp。从蜜蜂中分离得到的 apidaecins即是一类富含脯氨酸的多肽抗生素, 对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病菌的高杀伤力,使其在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着很好的应用前景[5]。 ( 3)含有一个二硫键的多肽 该类多肽很少见,但具有较强的抗菌活性。该类抗菌肽有在 C 端含有一个分子内二硫键,在 C 端一般含有一个由 7 个氨基酸组成的环链结构Loop structure ,且同时 N 端有一个长的“尾巴”结构。已知来源于牛中性粒细胞中的 Bactenecin 是第 1 个被发现的此类多肽,在其第 2 位和第 11 位氨基酸残基间形成二硫键,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较强的活性[6]。 (4)含有两个或两个以上二硫键的多肽 这类多肽的典型代表是 defensins,最初在哺乳动物的组织中发现的 α-defensins 即是这一类,其一般含有 29~34 个氨基酸残基,其中 6 个保守的半胱氨酸形成 3 个分子内二硫键。 defensins 对多种细菌和某些1真菌具有杀伤作用,并且对真核细胞有一定的毒性。 defensins 对革兰阳性菌的活性比革兰阴性菌强[7]。 (5)羊毛硫抗生素 是一些由细菌产生的,含有一些特殊有机基团的多肽抗生素。其中研究最广泛的是 nisin。它是来源于乳酸菌的一种抗菌肽,成熟多肽由 34 个氨基酸组成,含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因。主要对革兰阳性菌起作用,而对革兰阴性菌不起作用[8],已被广泛应用作食品保鲜剂。 1.1.2 抗菌肽的功能 抗菌肽具有广谱抗菌作用,除此之外,研究表明抗菌肽还对真菌、病毒、肿瘤细胞和一些原生生物包括寄生虫等都有一定的抑制作用。 (1)抗菌肽的抗细菌活性 抗菌肽的抗菌谱广,对革兰氏阴性菌和 革兰氏阳性均有较强抗菌活性,至今发现至少有 113 种以上细菌能被抗菌肽所杀灭,致死浓度可达到 μmol/L 级[9]。 (2)抗菌肽的抗真菌活性 最先发现具有抗真菌肽是从两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素(Magainins ),研究发现它不仅作用于革兰氏阴性菌和革兰氏 阳性,而且对真菌及原虫也有杀伤作用。 Lijima 等首次从麻蝇幼虫血淋巴分离出多肽 AFPantifungal peptide,因发现其能抑制白色假丝酵母 Candida albicans 的生长而得名[10]。迄今为止,已发现 CereopinA,Myfimycin, Thanafin 和 Drosomycin 等生物活性小肽都具有抗真菌的作用,而对人体细胞无明显毒性。 (3)抗菌肽的抗病毒活性 有一些抗菌肽对病毒也有一定的杀伤作用, 这也是从 80 年代才逐渐被人们所认识的。文彪等通过往蚕体内注射两性抗菌肽类物质,从而提高家蚕对多角体病毒的抵抗力,大大降低了家蚕的发病指数[11]。另外大量研究表明,两性抗菌肽如天蚕素等能抑制病毒感染细胞的融合及病毒颗粒的扩散。对 I 型人免疫缺陷病毒 human immunodeficiency virus HIV)可起到抑制因子的作用。WachiIlge[12]等1998 通过天蚕素和蜂毒素处理离体 HIV 感染 T_细胞和成纤维细胞同样为此结论提供了有力的证据。 (4)抗菌肽的抗肿瘤活性 某些抗菌肽还具有抑瘤作用,对肿瘤细胞的体外共培养,发现某些抗菌肽可以抑制肝炎病毒 DNA 的复制,使宫颈癌细胞细胞膜异化,细胞器等变形,从而抑制肿瘤细胞的生长。 很多早期研究也表明昆虫阳离子抗菌肽 Cecropins 具有抗多种瘤细胞2活性,甚至包括对多重耐药性肿瘤细胞具有杀伤活性[13]。赵东红,张双全[14]等通过比较家蚕抗菌肽对癌细胞和人血白细胞的作用, 也证实抗菌肽能使癌细胞骨架和核骨架断裂、萎缩,最后解体成碎片,而对人白细胞骨架无影响。 (5)抗原虫的特性 天蚕素和其合成类似物对病原原生动物 都有一定的作用,包括其中的引起虐疾和锥虫病的寄生虫。研究发现,抗菌肽活性较强的 Cecropins 类具有抗原生动物类的寄生虫作用, 如利什曼虫等[15]。早在 1989 年 Jaynes[16]等以天然抗菌肽天蚕素 B 为蓝本,置换了其中许多氨基酸人工合成一新肽,并保持这些位置原有的极性,结果发现新抗菌肽分子的抗菌活性不 仅增强了而且还可以杀死病原虫。 1.1.3 抗菌肽的杀菌机制 对于抗菌肽的抗菌机制有很多种说法,科学家们把它们概括为三种模型,桶 -板模型(图 1.1a)、螺管模型(图 1.1b)、毯式模型(图 1.1c)[17]。其中比较普遍被接受的一种说法,认为抗菌肽为阳离子肽,它在发挥抑菌作用时,首先与细胞膜上的负电荷发生静电吸引,吸附在细胞膜表面,使细胞膜破坏, C 端疏水部分插入质膜中,然后两亲性 α-螺旋也插入质膜中,导致细胞内各种离子及内容物泄漏,最终细菌死亡[18]。研究表明,抗菌肽的结构及一些理化性质与它们的抗菌活性密切相关。主要包括(1)分子质量大小;(2)氨基酸的组成;(3)螺旋结构的倾向性;(4)静电荷;(5)结构疏水性;(6)两亲性[19-21]。尤其是 Cecropin 类抗菌肽的 α-螺旋与其抗菌活性有着很大的关联[22]。许多研究表明,α -螺旋结构对 Cecropin 类抗菌肽维持其活性是必需的,特别是那些与膜结合的多肽,尤其需要稳定的 α-螺旋结构[23]。对 BmcecB和 DmcecB 进行生物信息学分析比较,发现 DmcecB 和 BmcecB 相比, 螺旋倾向更高。另外,尽管它们的静电荷相差不大,但是在等电点和疏水性方面, DmcecB 都比BmcecB 高,其中更高的疏水性在其渗透入细胞膜的过程中发挥着重要作用[24]。对于在其它类似的抗菌多肽中,基于这些方面的综合考虑,研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理,可以进一步对一些天然的抗菌肽分子通过人工设计进行改造,例如可以通过比较已知结构的天然抗菌肽序列提出 序列模型,使之具有合适的肽链长度、 α-螺旋和更高的两亲极性,则可能获得活性更高,抗菌谱更广的抗菌肽。 3
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