足球比分直播

肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf

返回
肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf_第1页
第1页 / 共44页
肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf_第2页
第2页 / 共44页
肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf_第3页
第3页 / 共44页
肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf_第4页
第4页 / 共44页
肿瘤抑制基因p53的动力学分析.pdf_第5页
第5页 / 共44页
点击查看更多>>
资源描述:
河北工业大学硕士学位论文 - iii - THE STUDY ON THE DYNAMICS OF THE TUMOR SUPPRESSOR GENE p53 ABSTRACT When the genomic integrity of a cell is challenged, its fate is determined in part by signals conveyed by the tumor suppressor protein. It was observed in the experiments that p53 protein can respond to DNA damage or Hypoxia by various stresses both intrinsic and extrinsic to the cell, such as physical or chemical factors, including gamma or UV irradiation, ionizing radiation, as well as reaction with oxidative free radicals, activate and regulate its downstream genes to initiate the program of cell cycle arrest to repair the damaged DNA, or the program of cell apoptosis when the damage to DNA is too severe to repair. No matter how p53 responds to the signal, it is able to control the limitless reproduction of cells effectively, and thus to prevent the tumor. The Mdm2 oncogene, an important negative regulator of tumor suppressor gene p53, plays an extremely important role in regulating the level of p53 and stabilizing organisms. p53 induces the expression of Mdm2 gene, whereas the expressed product Mdm2 protein negatively regulates p53, so they a p53-Mdm2 negative feedback loop based on protein level. p53 and Mdm2 are two important nodes respectively in the signaling transduction network, and the negative feedback loop between both of them is the core of this network. The central work of the study in this passage is the dynamics of p53. For convenience, the paper discusses just the dynamics of p53 in individual living cells, and the main work is embodied in chaps three and four. The analytical stationary state solutions-stationary points to the equations from the ready-made model with three variables 肿瘤抑制基因 p53 的动力学研究 - iv - about p53 and its dynamical equations have been obtained, the nonlinear equations have been made linear by using nonlinear dynamical , and then using linear stability theorem and Routh-Hurwitz criterion the stability of the stationary points has been analyzed. In order to make it easy to generate oscillations for the system and given the details of the interaction between p53 and Mdm2, we introduce time lags based on the original model, as well as two new variables-active p53 and signal. Besides, DNA damage switch is introduced to control p53 network on or off, and thus we found the modified model. Without DNA damage, p53 network is off, so it stays in the steady state; whereas DNA damage is present, p53 network is turned on, the signal S is activated, and the system responds to DNA damage in the of oscillations. At the end of the passage, we have reduced five variables to three under certain condition, namely inactivated p53, Mdm2 and signal, so reduced model can be obtained, and it is also able to generate limit-cycle oscillations easily. The dynamical properties are compared with that of the model without reduction, only to find they both have extremely similar limit cycles, and the reduced model can reflect partly the dynamical properties of its prototype, so to a great extant, the modified model is reduced. KEY WORDS p53, Mdm2, negative feedback, robustness, steady state, stationary point, oscillate, limit cycle, bifurcation, three-variable model, modified model, reduced model tw-*㈣}&№i g¨*mnm*、m{_~fE L”mm*∞mm镕z十L.垃注月{f月m自*十n』mwf,[m*H、Ⅱa“tv*“*∞L0Ⅱ&m}目g】L&∞”Ⅱ¨w4*女J9『】_u&∞”fE”*Ⅲurn∞№十㈣目Bn女十H¨mhq}Ⅱ*tE r“№,¨0J∞n㈨{£Imom“¨*。{踏 “却¨q’*十学位*文版权使月授权∞*口}≈e r,』JL』__I_々*J№m m“¨J{J。}n≈z∞&t-4tm rm_oM{&Ⅲm%女}&№女∞Ep目十Ⅻm r№{{KnmR“々nmi∞E¨wⅫm r,F*HJⅢ%日“&}nmKtt&~“*z々KHH*mHmntuⅡ“”{}*≈女}j女*mH∞㈣t&fJH{t“tⅦⅢ-u H女“x“f Jmn∞口≈№女Ho¨目自fmn十“Ⅸ“*n∞∞Ⅲm r}R-dum u1Ⅱdmzm日*4十目gⅢT≠Ⅻ {*镕∞*№女惭a日}&“}Ⅲ1百寸}问枷逆“g燃;e目性。河北工业大学硕士学位论文 - 1 - 第一章 绪 论 随着肿瘤发病分子机制研究的逐步深入和分子生物学技术的迅速发展,肿瘤基因及相关治疗治疗已成为人们研究的焦点、热点。现在人们知道,所有肿瘤的发生都是源于一些肿瘤相关基因的突变。基因突变通常发生于与细胞发育、细胞增殖、细胞分化、细胞存活、以及细胞遗传学修复等相关的基因中。其中一些涉及细胞生长正调节的基因通常称之为癌基因(或称为致癌基因),而涉及细胞生长负调节的基因则称之为抑癌基因。本文所要研究的 p53 和 Mdm2 就分别属于抑癌基因和癌基因。一旦癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破,控制细胞增殖的癌基因持续或过高表达,同时抑癌基因不表达或失活,就会导致各种肿瘤的形成和发展。 p53 基因是人体内最有效的天然抗癌基因之一。早在二十多年前,就有一篇报道描述了致癌病毒与53k的宿主蛋白host protein 相互作用。后来,该宿主蛋白被称为p53,由于其具有防止细胞非正常增殖的功能,所以人们逐渐认识到它是一种肿瘤抑制基因[1]。 截至目前,人们已经通过各种手段或方法发现了多种抗癌基因,如p53 , p21, p16, PTEN, FHIT,BRCA1/BRCA2 等[2]。在人类研究肿瘤过程中发现,许多癌基因和抑癌基因常常以家族的形式存在,肿瘤抑制基因p53 也是如此。直到 1997 年以后,人们才相继发现了p53 家族的新成员,如KET 、 p40、 p51、p73、p63 、p53CP 、NBP 等[3]。由于其中的肿瘤抑制基因家族p53 是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因,在肿瘤中p53 基因突变的几率高达 50以上,所以 p53 最受关注,是目前人们研究得最为广泛、最为深入的抑癌基因之一,相关的研究论文平均每年超过 1000 篇,并被Science 杂志评为 1993 年度的明星分子[4]。 肿瘤抑制蛋白p53 是复杂的信号传导网络中的一个主要节点,能够感知如DNA 损伤、 癌基因的激活、病毒感染以及核苷酸的损耗等各种细胞刺激。作为转录激活因子, p53 在控制细胞周期及其凋亡中调控着多种基因的表达,在多细胞动物中具有高度进化保守性功能,被誉为基因组的保护神。通常情况下p53网络是关闭的,而且其表达处于较低的水平,但是当细胞受到能够改变正常的细胞周期进程或能够诱导基因组突变而具有癌变倾向的刺激时[5],p53 会被激活,进而调节其下游基因对刺激信号作出响应,如对受损的DNA 进行修复、阻滞细胞周期进程或使细胞发生凋亡等来控制细胞的无限增殖,起到抑制肿瘤的作用。 本文从 p53的已有模型出发,以 p53-Mdm2负反馈环为核心重点研究了该非线性系统的动力学问题,并进一步考虑生物体内具体的生物化学过程,对已有的模型进行改进,定性地模拟了在有刺激信号输入肿瘤抑制基因 p53 的动力学研究 - 2 - 的情况下 p53 及 Mdm2 的动力学行为。 经过多年的研究,人们对p53 的结构已有了明确的认识,对p53 基因的功能研究也取得了重要进展。现在对p53 的研究已经进入到实际应用阶段,比如我国首个批准了人类癌症的基因疗法。最近,在对p53研究方面又取得了一些新进展人们可能利用一些小分子药物,通过阻止 Mdm2 与p53 的结合来激活p53,其意义在于这些药物更容易被吸收而广泛分布于人体的各个部分,从而进入细胞达到它们的靶位点,为癌症的绿色基因疗法带来了希望[1]。 目前,细胞癌基因的研究已由单一基因发展到对多基因协同作用和相互调节机制的研究阶段。p53与多种基因之间均存在相互调节的作用,但对其中大部分的调节机制尚不明确,尚存在许多问题。比如说是什么样的刺激激活了p53在正常细胞中响应DNA 损伤时能观察到p53 脉冲吗当损伤被修复后p53 脉冲会终止吗如果修复被中断,p53 脉冲会引起细胞凋亡吗如果所有这些猜想都被证实,那么p53 响应的主要分子机制是什么呢细胞又是怎样数p53 脉冲数目的呢[6]还有,哪些后转录修饰对于p53 的功能是必要的p53 是如何诱导细胞凋亡的p53 被激活后细胞是如何在生存与死亡之间决定自身命运的最近识别出的p53 的同族体p63 和p73 的功能是什么,以及这些基因之间也会发生相互作用来控制细胞周期吗[5] 人们对 p53 的研究才刚刚起步,由于缺乏相关的实验数据,所以人们对 p53 的许多动力学行为仅仅是假设或猜测。但是,我们相信随着对 p53 研究的不断深入,人们对它的了解会越来越多,相关疑问将逐步得以解决,而且随着现代医学的日益发展,实现人类肿瘤的基因治疗指日可待。 河北工业大学硕士学位论文 - 3 - 第二章 关于 p53 的生物学背景 § 2-1 癌基因与抑癌基因 正常细胞的生长与增殖是由癌基因oncogene 和抑癌基因anti-oncogene 进行调控的,前者可促进细胞的生长与增殖,大多数通过生长因子及其受体发挥作用;后者可抑制细胞增殖,促进分化、成熟、衰老和凋亡。 癌基因最初的定义是指在体外引起细胞转化、在体内诱导肿瘤的基因。目前认为广义的癌基因应当是凡能编码生长因子、生长因子受体、细胞内生长信息传递分子,以及与生长有关的转录调节因子的基因均归属癌基因的范畴,本文涉及到的 Mdm2 基因就属于癌基因。癌基因分为病毒癌基因virus oncogene, 简写为 v-onc 和细胞癌基因cellular-oncogene, 简写为 c-onc ) ,后者也称原癌基因proto-oncogene。病毒癌基因是一类存在于肿瘤病毒(大多数是逆转录病毒)中的、能使靶细胞发生恶性转化的基因;细胞癌基因是存在于生物正常细胞基因组中的癌基因。癌基因具有以下特点(1 )广泛分布于生物界;(2 )基因序列呈高度的保守性;( 3)其表达产物对细胞正常生长、繁殖发育和分化起重要作用;(4 )在某些因素作用下,一旦被激活发生数量和结构上的变化,形成癌性的细胞转化基因,可能引起细胞恶变形成肿瘤。 癌基因的活化有四种方式(1 )获得启动子和增强子;(2 )基因异位;(3 )原癌基因扩增;(4 )点突变。不同的癌基因可通过不同的途径被激活。癌基因被激活的结果是(1 )出现新的表达产物;(2 )出现过量的正常表达产物;(3 )出现异常、截短的表达产物。 癌基因编码的蛋白和细胞生长因子参与细胞生长、增殖、分化多环节的调控。根据在细胞信号传递系统中的作用将癌基因的表达产物分为四类( 1)细胞外的生长因子,作用于相应的受体细胞,使大量生长信号持续输入,细胞增殖失控,如 v-sis 和 c-sis 的表达产物;(2 )跨膜生长因子受体,能接受细胞外的生长信号,跨膜受体在细胞内的结构区域具有酪氨酸蛋白激酶活性,如 c-src、 c-abl 等的表达产物;(3 )细胞内信号传导体,能将胞内信号传递至核内,促进细胞生长,如 c-src、 c-abl 的编码产物具有非受体酪氨酸激酶活性、 ras 编码的产物有 GTP 活性;(4 )核内转录因子,具有调控靶基因转录活性的作用,如 myc、fos 等的编码产物。 抑癌基因是一类抑制细胞过度生长、增殖,从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因与调控生长的原癌基因协调表达以维持细胞的正常生长、增殖和分化。抑癌基因的丢失或失活可能导致肿瘤发生。常见的肿瘤抑制基因 p53 的动力学研究 - 4 - 抑癌基因有 10 余种,目前仅对 p53 和 Rb 的作用机制有较为深入的了解。 § 2-2 肿瘤抑制基因 p53 2-2-1 p53 的结构、表达及各功能区的功能 p53 基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后,对其进行了定位。人类 p53 基因位于人类染色体 17p13.1,而鼠的 p53 基因位于 11 号染色体,并在 14 号染色体上发现无功能的假基因。进化程度迥异的动物中,p53 有异常相似的基因结构。 p53 基因全长 16~ 20kb,由 11 个外显子和 10 个内含子组成,第一个外显子不编码,外显子 2、 4、5、7 、 8 分别编码 5 个进化上高度保守的结构域,p53 基因的 5 个高度保守区即第 13~19 、 117~142、171~192 、 236~ 258、 270~286 编码区(见图 2.1)。 p53 基因转录成 2.5KbmRNA,编码 393 个氨基酸的蛋白, 相对分子质量为 5.3104,故称为p53。 p53 基因的表达至少受转录及转录后两种水平的调控。在停泊生长或非转化细胞中 p53mRNA 水平很低,但刺激胞液后 mRNA 显著增加。持续生长的细胞,其 mRNA 水平不随细胞周期而出现明显变化,但经诱导分化后 mRNA 水平降低,部分是转录后调控。 p53 基因的转录由 P1、 P2 二个启动子控制。 P1启动子位于第一外显子上游 100~250bp , P2 位于第一内含子内,在启动子中包含 1 个 NF1 蛋白结合位点和一个转录因子 AP1 相关蛋白的结合位点,对正常 p53 基因的转录,不仅需要二个启动子的平衡作用,而且 p53 基因内含子也起作用,如内含子中有正调控作用,其调控具有组织特异性。 p53 蛋白在结构上按功能可分为五个区域 N-末端的转录活化区(1 ~50 位氨基酸)、信号区(60 ~94 位氨基酸)、顺序专一的 DNA 结合区(100~290 位氨基酸)、四聚体化区(323~355 位氨基酸)和C-末端的非专一 DNA 结合区(370~ 393 位氨基酸)。p53 蛋白的结构域如图 2.1 所示 河北工业大学硕士学位论文 图 2.1 p53 蛋白的结构域、六个高突变位点精氨酸 175、甘氨酸 245、甘氨酸 248、精氨酸 249、精氨酸273、精氨酸 282 和五个高度进化保守区Ⅰ- Ⅴ。 Fig. 2.1 The domains of p53, six most frequently mutated sites R175、 G245、 G248、 R249、 R273、 R282 and five high evolutionary conserved regionsⅠ- Ⅴ. 折叠后的 p53 蛋白如图 2.2 所示 图 2.2 折叠后的 p53 蛋白 Fig 2.2 Folding p53 protein p53 蛋白结构的五个功能区分别具有各自的功能,它们之间相互协调,共同行使 p53 蛋白抑制肿瘤的生物学功能。 (1 )p53 N- 末端转录活化区的功能 p53 蛋白是一个转录因子,可激活转录,介导蛋白间的相互作用。 p53 的转录活化受到腺病毒Adeno VirusE1B55KD 蛋白及人 Mdm2 蛋白的抑制。Mdm2 N- 末端形成一个疏水表面的中极两性螺旋,指向并插入疏水袋,其中 p53 的第 19 位苯丙氨酸、23 位色氨酸、 22 位亮氨酸在与 Mdm2 的结合中起重要作用。Mdm2 通过占据 p53 转录活化区与基本转录装置相互作用的疏水界面而起到抑制 p53 转录活化- 5 - 肿瘤抑制基因 p53 的动力学研究 的作用。 (2 )p53 信号区的功能 此区 34 个氨基酸中有 12 个脯氨酸,含 5 个脯-X-X- 脯重复序列,可组成一个Ⅱ类左手脯氨酸螺旋,产生一个 SH-3 区结合部位。实验结果表明, p53 信号区不是转录活化所需要的,其功能在于借助其 SH-3区的结合活性,把 p53 直接与信息传递途径连接起来。 (3 )p53 DNA 结合区的功能 该区域具有特异结合 DNA 的功能。研究发现,此区域折叠成 4 条链及 5 条反向平行的两个 β-片层,它们也是直接与 DNA 相互作用的两个 α-螺旋的支架。四聚体的 p53 蛋白与交感 DNA 序列 5′-PuPuPuC A/T -3′的四个重复序列结合。 120 位赖氨酸、 241 位丝氨酸、 273 位及 283 位精氨酸、 276 位丙氨酸与p53 靶基因 DNA 主沟的磷酸盐骨架接触, 120 位赖氨酸、 277 位半胱氨酸、 280 位精氨酸与靶基因 DNA的碱基通过氢键相互作用,而且 248 位精氨酸与靶基因 DNA 的次沟利用多个氢键接触。p53 90 以上的误义突变发生于此区,有两类248 位及 273 位精氨酸的突变频率最高,破坏 p53 与 DNA 的接触,使 p53 失去转录因子的功能;第二类突变发生于 175、 249 位精氨酸和 245 位甘氨酸,破坏了 β-片层的结构基础。因此,有 40以上的突变定位在 175 位、 248 位、 249 位、 273 位精氨酸及 245 位甘氨酸上。p53 就是通过此区与靶基因中结合元件的结合激活靶基因的转录而行使其生物学功能的。该区域与 DNA结合后如图 2.3 所示 图 2.3 p53 蛋白的核心区域(左)与 DNA(右)结合的结构。图中还显示了人类癌症中突变率最高的六个氨基酸p53 与 DNA 结合的重要氨基酸残基。图中的小球为锌原子。 Fig. 2.3 The structure of the core domain of the p53 protein left bound to DNA right. The six most frequently mutated amino acids in human cancers are shown-all are residues important for p53 binding to DNA. The ball represents a zink atom. (4 )p53 四聚体化区的功能 - 6 - 河北工业大学硕士学位论文 - 7 - 该区又称寡聚化区,介导 p53 蛋白自身聚合形成四聚体,天然的 p53 蛋白在溶液中为四聚体。此区326-333 位氨基酸形成 β-片层,335-354 位氨基酸形成 α-螺旋, β-片层与 α-螺旋形成一个 V 型结构。p53在活体中的活性有确切的阈值,将其活性维持在阈值之上需要寡聚化。 (5 )p53 非专一 DNA 结合区的功能 即 p53 的 C-末端或羧基端,可与DNA 非特异性结合,参与核心区与DNA 结合的错构调节,并与互补单链DNA 寡聚核苷酸的重新退火有关[7]。 2-2-2 p53 的分类 p53 基因可分为野生型p53 wild-type p53, wtp53 和突变型p53 mutant-type p53, mtp53 两种[8]。p53蛋白正常功能的丧失,最主要的原因是由于p53 基因突变。迄今已发现 10000 种人类肿瘤的 2500 种基因突变,p53 蛋白 393 个氨基酸中有 280 个以上发现了突变。可见,p53 基因突变是p53 正常功能丧失的常见原因[9]。另外,一些蛋白与p53 蛋白作用也可以导致其正常生物学功能的丧失。 wtp53 能够抑制某些促使细胞进入有丝分裂的酶的活性,阻止细胞进入 DNA 合成期,抑制细胞的分裂和增殖,并且使 DNA 损伤有充分的时间修复,即使不能修复, wtp53 蛋白还能启动细胞凋亡程序,防止细胞的恶性转化。因此, wtp53 参与细胞周期的调控,在维持细胞生长、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用。当 wtp53 转化为 mtp53 时,则失去对细胞的抑制作用,促进细胞转化和过度增殖,导致肿瘤的发生。 正常细胞中p53 蛋白半衰期很短 6 ~20min ,含量极微,而在癌细胞和转化细胞中可高达 100 倍。当细胞DNA 损伤后,wtp53 基因过度表达,使受损细胞停滞在G1/S期修复或凋亡,并激活Bax 基因,进一步解除bcl-2 基因对细胞凋亡的抑制。 mtp53 蛋白不仅失去对细胞异常增殖的抑制作用,而且部分表现出癌基因的促进细胞异常增殖的作用,使细胞的全部表型出现恶化[8]。 mtp53 蛋白并非仅仅丧失了wtp53 的肿瘤抑制功能,而且还获得了许多新的生物学功能,主要包括(1 )失去了与细胞核内特异性DNA 结合部位结合的能力,并且不能与p53 结合蛋白结合或仅能微弱地结合[10];(2 )丧失了促进前B 细胞分化的功能,因此细胞会停滞在相对未成熟期而引起细胞过度增殖[11];(3 )稳定性增强且能与HSP70 结合,致使核内wtp53 蛋白转运至胞质中而丧失了调控细胞增殖的能力[11];(4 )获得了显性负效应dominant-negative effect ,即mtp53 可使wtp53 的正常活性受到抑制,从而产生类似纯合突变的效应,导致细胞的恶性转化[12];( 5)某些 mtp53 还获得了显性正效应dominant-positive effect,即 mtp53 产生了wtp53 所没有的新功能[13]。因此, p53 发生突变后不但会丧失其抑癌基因的功能,而且还可能获得某些癌基因的功能。
展开阅读全文
收藏
下载资源

加入会员免费下载





足球比分直播