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紫外线B辐射下NO的产生机制与其对光合电子传递链的保护作用.pdf

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缩写词表Mes 2-fNmorpholinoethane sulfonic acidNADH Nicotinaamide adenine dinucleotideNADPHNicotinaamide adenine dinucleotidephosphateNBTNRN0NOSPAGEpBSPoDPS lPSllROSRubiscoSDSSNPSODTEMEDTricine1’rjsUV二BNitroblue tetrazolium chlorideNitrate reductaseNitric oxideNitric oxide synthasePolyacrylamide gel electrophoresisPhosphate buffered solutionPeroxidasePhotosystem IPhotosystem IIReactive oxygen speciesRuboluse bisphosphate carboxylaseSodium dodecyl sulfateSodium nitropmssideSuperoxide dismutaseN,N,N’,N’一tetramethylethylene diamineNtris一hydorxymethylmethylglycinetris一hydorxymethylamino methaneUltraviolet.B2一N-吗啉代乙烷磺烟酰胺腺瞟呤二核苷酸,辅酶I烟酰胺腺瞟呤二核苷酸,辅酶II氮蓝四唑硝酸还原酶一氧化氮NO合酶聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸缓冲液过氧化物酶光系统I光系统li活性氧自由基核酮糖二磷酸羧化酶十二烷基硫酸钠硝普钠超氧化物歧化酶N,N,N’,N’.四甲基乙二胺N-【三羟甲基】甘氨酸--羟甲基氨基甲烷紫外线B摘 要摘要以红芸豆Phaseolusvulgaris离体叶片为材料,采用连续UV-Bt.3W/m2照射,通过外源NOSNP以及一氧化氮合酶NOS的两种抑制剂L.NNA和LNAME处理,研究UV-B条件下植物细胞内NO释放机理及其与活性氧H202的相关关系,阐述在植物中N0作为信号分子对这种环境胁迫积极响应的促进作用。发现1.增7_虽uv·B胁迫下,红芸豆离体叶片中H202含量的变化与NO合酶活性的升高和NO释放量的增加呈正相关。9b源,H202处理更能直接刺激体内NOS活性的升高以增加NO的释放,并且H202的处理浓度越高相应的NOs和NO变化越显著。表明NO的释放量的增加可以通过H202这种活性氧诱导NOs活性的升高被uⅥB辐射这种环域胁泊所湔好。2.通过外源NOSNP和L.NNA,L.NAME两种NOS抑制剂处理,研究发现植物体内NO的含量,能影响植物抗氧化系统r扣APX、POD、CAT和类黄酮等物质对UV-B胁迫的响应。在一定范围内相对较高浓度的NO可以促进植物体对胁迫的积极应答,从而缓解UVoB胁迫对植物体造成的伤害。由此可见,植物体内一定浓度的NO是保证胞内受体感受环境胁迫信号,并将其逐级传递的重要因素。3.通过叶绿素荧光动力学,SDS一聚丙烯酰胺凝胶和蓝色温和胶电泳,研究NO对uV.B照射下光合电子传递链的结构和功能的影响。发现,外源NO能阻止类囊体膜上的蛋白复合物PS I、Ps 11、LHC II和ATPase的降解,从而对维它们功能的正常发挥具有显著的保护作用。关键词紫外线BUV-BNO合酶NOS一氧化氮NO活性氧ROS抗氧化酶类囊体膜光系统IIPSll红芸豆4AbstractAbs仃actExcised leaves of kidney beanPhaseolus vulgariswere used to study themechanisms of nitric oxideN0generation by plant cells under UV-Bultraviolet-Bstress,and the relationship between NO synthesis and reactive oxygen speciesROS,e.g.H202.Treatments with exogenous NOSNP,L-NNA and L-NAMEirthibitors ofNO synthasewere used to exmnine the effects of NO signaling pathway under UVstress.1.Endogenous NO contents and the activities ofNOS in excised leaves of kidneybean increased wi廿l the duration of Uv_B irradiation.and were poskivelycorrelated with endogenous H202 content.Treatment with exogenous H202 canenhance NO synthesis by increasing NOS activity.Thus,NO generation can beinduced by ROS,such as H202,production during abiofic stresses such asI TVB stress.2.Treatments wit}l exogenous NO,L-NNA and LNAMEinhibitors of NOSaffected response to UV-B stress of ROS scavenging system in plant,e.g.changes in APX,POD,CAT and flavonoids.To a certain extend,highconcentration of NO activated defense mechanism in plant to prevent damageby UV-B stress.Therefore NO is likely to act as a receptor to sense ahioticstress,and as a signaling molecule to activate defense response.3.Chlorophyll fluorescence kinetics technique.SDS-PAGE and BNPAGE wereused to study NO effects on structure and function of the photosynthesis andelectron transport chain under UV-B irradiation.NO appeared to preventdegradation of protein compls on th3,lakoid membrane,such as PSI andLHC II,as well as the decrease of Fv/Fm,Yield.ETR resulted from the UV-Bstregs5AbstractKey wordultraviolet BuvB,nitric oxide synthaseNOS,nitric oxideNO,reactive oxygen speciesROS,antioxidant enzymes,thylakoid membrane,photosystem『I fPS II,kidney beanPhaseotus vulgaris6第一部分前言第一部分前言NO的性质和产生途径一氧化氮nitric oxide,NO是~种不带电荷的、顺磁性的气体自由基,具亲脂性,微溶于水1.95mmolL’1 atl00 kPa和20℃Henry等,1997,在水溶液中的扩故系数接近于02和02’。NO的Stokes半径很小,且由于它的电中性,因而很容易进行跨膜扩散Lancaster等,1996。与其它自由基相比,NO不发生聚合反应也难于进行歧化反应,所以有着较长的生物半衰期。在浓度较低的情况下,N0的半衰期约有几分钟到几小时,使得它可以穿过若干层细胞在细胞间长距离穿梭,刺激细胞做出应答Henry等,1997。高浓度时,NO的半衰期很短,几秒钟就可能失活。NO的半衰期同样也取决于它所在部位结合位点例如,蛋白质、血红蛋白、铜、半胱氨酸、抗坏血酸、氧i,Hz02的浓度。通过对植物代{9{中NO产生途径的研究发现,植物细胞可以通过NO合酶nitricoxide synthase,NOSFanggqing等,2003、硝酸还原酶nitrate reductase,NRYamasaki等,2001和亚硝酸还原酶NiR、或非生化反应途径产生NOCooney等,1994;Henry等,1997;Horemans等,2000,因而植物体内有足量的、达可测水平的内源NO信号分子支持活跃的生理代谢活动。早期发现高等植物中存在类似于哺乳动物NOS的证据是Ninnemarm年[1Maier1996在豆科植物Mucurta hassioo中检测到NOS的活性,Cueto等1996在Lupinusalbus根和茎中也发现NNOS的活性,随后Delledonne等1998和Duemer等1998分别在烟草和大豆中也检测NNOS的活性,并且这种活性受到动物NOS抑制剂N一硝基.左旋.精氨酸甲酯N”一nitroLarginine methylester,L-NAME和硝基一L一精氨酸No-rfitro.Larginine,L-NNA等的抑制。植物中的NOS为含铁的单氧酶,通常其分为结构型cNOS和诱导型iNOS,前者为钙离子依赖的酶。在NADPH作为电子供体和02的参与下,NO合酶催化L一精氨酸转化成NO和L-瓜氨酸,1989年Casino等用放射标记法进行光谱分析证实由NOS酶促生成的NO,其氮原子来于L.精氨酸,氧原子来源于氧气。植物中NOS的编码基因或cDNA序列以及与NOS高度同源的蛋白的分离是研第~部分前言究的热点,利用动物NOS的抗体检测植物NO合酶的研究己广泛展开。Kuo等1995用老鼠大脑NOS抗体和Western印迹技术分离出酵母和麦芽中的相关蛋白。Sen和Cheem1995利用野兔NOS抗体从豌豆胚轴中分离出分子量为105.4 kD的蛋白,从麦芽中分离出分子量分别为89.7kD和57.5kD的蛋白。电子显微镜的免疫定位表明,这些类似NO合酶主要存在于过氧化物酶体、叶绿体、细胞基质和细胞核中Barroso等,1999;Foissner等,2000;Huang和Knopp,1998;Ribeiro等,1999。研究发现许多NOS的抑制剂能够抑制植物中类似的NOS活性从而减少NO的释放,如Lum等2002发现外源H202可以诱导大豆叶片产生NO,并且该反应受NOS抑制剂L-NAME和Ca2通道抑制剂异搏定verapamil的抑制,因此认为H202能通过诱导NOS生成N0,并需要Ca2参与。除NOS},植物还可以通过氮代谢中的关键酶硝酸还原酶NR和亚硝酸还原酶NiR以NADPH肘ADH作为电子供体催化硝酸盐或亚硝酸赫的单电子还原反应产生NOCrawford等,1995。如在含有N02茅I]NADH的缓冲液pH 7.O中加入玉米的NR,可检测到NO的产生,未加NR则无NO释放Yamasaki等,1999,且该反应能被NO的抑制剂血红素所抑制,在相同条件下,把底物换/32NO,‘,NO的释放量也会大大减少。硝酸盐在一定的pH、耗氧量和还原剂存在的情况下通过非酶促反应产生NO在生物组织中占有重要地位。与NR催化产生NOSH反,在酸性环境中亚硝酸盐很容易转化为NO,此反应需要未解离的N02’HN02,PK3.2,其可能是生物组织在特定条件下NO的合成途径Weizberg和Lunberg,1998。二.NO的生理功能及其在环境胁迫中的作用以动物为材料的研究表明,NO具有双重性质。植物体中,在不同的细胞的生理条件和浓度下,NO同样表现出剂量效应Beligni和Lamattina,1999;。一方面,低浓度的N0能迅速清除超氧阴离子02‘-和脂质自由基R·,阻断包括脂质过氧化在内的活性氧reactiveoxygen species,ROS参与的各种伤害,并且诱导抗氧化酶的基因的表达,从而具有保护作用另一方面,虽然NO是一种非亲电性硝基化物质,但当其转化为NO、N02、N203和ONOO‘后就成为亲电性硝基化物第一部分前言质。NO的一个未配对的电子,很容易跟02、02’·以及其它几种含N的化合物发生反应。NO自然氧化后生成亚硝酸龄丽并非硝酸盐,细胞内形成的N203和N02标志着在NO自然氧化期间活性N和硝基化S的生成,NO的这些反应在水相中比气相中更容易进行。在供氧充足的情况下,NO矛IOf.反应生成ONOO‘Huie等,1993,其质子化可再形成过氧亚硝酸HoNoo。ONOO。和HON00都具有强氧化性,能破坏生物大分子的结构和功能,对植物造成伤害。如果没有02和其它氧化剂存在的话,NO在碱性环境中可以与硫醇基发生反应生成二硫化物*DN20,与仲胺反应可生成亚硝胺,与芳香族胺作用可导致脱氨。例如,DNA的不可逆脱氨作用引起基因的点突变。NO的毒性就是其能与可变态的金属蛋白和氧发生反应,或与稳定性易变的硫醇和氨基反应,并分别引起各自的化学性质改变的缘故Van等,1996。因此,高浓度的NO对细菌、真菌、寄生虫、肿瘤、病毒以及高等生物均有毒性。NO的作为生物体中的一种活性小分子,参与了植物生长发育的很多过程。如种予萌发、去黄化、下胚轴生长和叶的伸长等光敏色索调节的光控发育过程以及根的生长、花的形成、果实成熟及衰老起到重要作用Beligni和Lamattina,2001a由于植物的大多数生长发育现象都受到植物激素的调节和控制,所以通过激素起作用可能是植物体内NO作用的机理之一。有些植物如莴笋、泡桐等种子的萌发需要一定的光照,使用NO供体SNP能使莴笋种子在黑暗条件下也能萌发,并且种子的萌发率与SNP剂量成正比,而N02“和N03“对种子萌发则毫无影响Beligni和Lamartina,2000。植物叶片的生长受至rJNO的调节Leshem和Haramaty,1996。NO还促进根器官的形成,使用多种释放NO的化学药品对玉米离体培养的根进行处理时发现,根尖的生长和外源NO的释放浓度成正相关,而NO的胞内受体乌苷酸环化酶的抑制剂亚甲基蓝可以阻断这种作用。NO诱导根的形成表现出剂量效应,低浓度促进,高浓度抑制。研究表明,NOfiE与激素相互作用共同影响植物的生长,并且其功能与某些植物激素存在着重叠。有关NO与植物激素的最早报道是在植物衰老领域的研究。Leshem平lJHaramaty1996发现NO参与了乙烯的释放,在衰老的豌豆中NO束lJ激乙烯的产生。在成熟的过程中,成熟的果实中内源NO的浓度比绿色果实或开始衰老的花中低Leshem和Wills,1998;Leshem等,1998,因此认为NO和乙烯9第一部分前言的比率决定着植物的成熟和衰老。NO是吲哚乙酸IAA诱导根的形成信号途径的蘑要组成部分Pagnussat等,2002。NO或IAA均可促进黄瓜胚轴外植体根器官的形成,加入NOS的抑制剂,两者都不能促进根器官的形成。实验表明,用IAA处理黄瓜外胚轴能引起植物内源NO释放量的增加。水杨酸SA也是植物天然产生的生长调节物质之一。SA在植物抗病反应中的积累可以抑制过氧化氢酶而积累H20,从而直接杀灭病原体。SA也是植物系统获得性抗性建立的关键信号分子,NO与SA的关系较为复杂,不仅NO可以作为信号诱导SA合成,而且sA也可以激活植物NO合成途径。在水分胁迫下,小麦根尖NOs活性迅速上升,产生的NO是诱导脱落酸ABA积累的关键信号分子。细胞分裂素刺激NO的释放,人们在这方面已达成共识Tun等,2001。相信对生长过程fibNO与各种植物激素关系的深入研究将有助于阐明植物NO的作用方式。虽然NO与植物细胞凋亡的研究尚处于初级阶段.但与动物细胞一样,其对不同细胞的凋亡的影响存在差异,表现出诱导和抑制细胞凋亡的两面性,同时ROS在其中也可能起到重耍的作用。NO诱导细胞凋亡,Delledorme等1998用假单胞菌Pseudomotuts处理大豆Glycine max细胞悬浮体系发现,NO能使细胞积累ROS,发生过敏反应HR并诱导细胞程序性死亡,而外源NO诱导拟南芥悬浮细胞死亡,则不需要ROS的参与,具有哺乳动物细胞程序性死亡的特征Beligni等,2002。在N0抑制细胞凋亡方面,用能产生ROS的除草剂和病原体处理马铃薯Solanum tuberosum时发现,NO可以作为抗氧化剂阻滞细胞凋亡Beligni和Lamattina,1999。另外,外源NO供体在赤毒素GA的参与下可以延滞糊粉层细胞的程序性死亡,其相互作用维持CAT和SOD的活性,a-淀粉酶的分泌也有所增加Clarke等,2000。植物生活在多变的自然环境中,其不可避免的都会受到不良环境的影响。超过了植物正常生长的范围环境变化幅度,被称为逆境或胁迫stress。影响植物发育的胁迫因子分为生物胁迫、物理胁迫和化学胁迫。研究表明,植物受到病菌感染后能通过多种应激措施来抵抗侵害。在识别病原体的过程中,植物细胞反应产生化学物质和信号分子,其中的一些能激活感染部位的细胞的局部死亡,即过敏性细胞死亡hypersensitive cell death,从而限制病原体扩散。这种过敏反应hypersensitive response,HR发生前或同时,植物lO第一部分前言被感染的组织中有几个相关的蛋白家族PR的合成上升,感染位点产生的化学信号被传送到病原体感染位点远端即植株其它未受侵染的部位,诱导尸月一,等防卫基因表达,使植物产生长效、广谱的抵抗能力,即系统获得抗性SystemicAcquiredResistence,SAR。植物细胞对病原侵入的首先反应是氧爆oxidative burstWejtaszek等,1997Hausladen等,1998,即感染部位ROS的水平大大上升。氧爆的最初产物是02‘,但其半衰期短,很快就可以转化为不易扩散的H202和ONOO。,直接杀死病原体,抵御病原入侵。植物在受到病菌侵染大量产生ROS的同时,可以检测至qNOS活性的增加,由此释放的NODurner等,1998,以多种途径参与到植物抗病反应中Delledomle等,1998Dumer等,1998;Dumer和Klessing,1999,直接或间接杀灭病菌。NO的直接杀菌作用可能是通过--与02‘·反应生成ONOO’进行的Huie等,1993,而其间接杀菌作用表现在,NO可独立诱导植物防御反应初期基因的表达,以及诱导被感染部位的细胞凋亡,避免病菌扩散。尽管诱导寄主细胞死亡和杀死病原体的抗病反应需要ROS分子,但ROS本身不足以诱导植物产生足够强的抗病反应Dangl等,1998;Torees等,2002;Neill等,2002,其必须,IINO协同作用,激活植物防卫基因和过敏性反应Beligeni等,1997。例如,用NOS抑制剂处理拟南芥和烟草植株可以阻断过敏性抗病反应Dumer等,1998。受烟草花叶病毒感染后,抗病烟草植株体内NOS活性增加,而不抗病的植株体PqNOS的活性并不增加。用病原菌处理的大豆悬浮细胞进行的程序化凋亡实验和拟南芥植株受细菌Pseudomonas syringae侵染或真菌激发子诱导产生的过敏反应实验均能得到同样的结果。NO不仅同ROS有协同作用,而且还能通过依赖于水杨酸salicylic acid,SA的信号途径激活或增强植物防卫反应。在植物中,sA是涉及到生物胁迫应答的信号分子,尽管对其生物合成路径尚不完全清楚,但已有证据表明在病原感染引起的SA生物合成中,ROS和NO参与至IJSA合成过程中某些关键步骤的调控Kaiser等,2001,在植物依赖SA途径的防卫机制中发挥作用Van等,1998。例如,NO处理烟草叶片能诱导内源SA的大量增加,这种SA的增加是诱导PRJ基因表达所必须的。已有的一些模型认为,在信号自我放大过程中,SA可增强NO和NOS介导的氧化还原信号反应Delledonne等,1998;Dunner等,1998;Clark等,2000,早期实验获得的SA处理可增加大豆植株体第一部分前言内NO的产生支持这种观点Klepper等,1991。NO对苯丙氨酸解氨酶phenyrlalanine ammonia lyase,PAL在mRNA水平有调节能力,从而激活PALBeligni等,1997;Dunner等,1998,进一步诱导合成更多的sA。sA具有改变不同NO调控酶活性的能力,其中包括乌头酸酶、过氧化氢酶和其它几种血红蛋白Stamler等,1994,可见SA可通过一种选择机制介导和增强NO的作用Liu等,2003。总之,ROS、NO和SA之间存在着多种相互作用,它们在激活防卫反应和寄主细胞凋亡过程中的相互关系及复杂机制还有待进~步研究。环境胁迫下植物体内ROS大量产生,导致细胞内的氧化损伤,引起叶绿素降解、类囊体膜结构损伤、蛋白质变性、核酸断裂,乃至细胞死亡。NO的释放与ROS产生相偶连,并且作用于细胞膜结合的受体,诱导许多与不同胁迫信号相偶联的反应,激活和驱动细胞内和细胞问的信号级联转导,使细胞对非生物胁迫的刺激信号产生应答。干旱Drought、极端温度Temperature trems、脱水作用Dehydration、盐胁迫Salt、高光强辐射High light intensity、紫外辐射uV等各种非生物胁迫都可以诱导ROS产生。实际上,在各种胁迫quRos与NO相互作用,相互协同起来传递信号,以保证植物对逆境环境的适应。虽然NO能通过调节超氧的形成和抑制脂质过氧化作用起到抗氧化功能,保护植物免受环境胁迫的伤害,但是过量的NO也会引起亚硝基化胁迫nitrosative stress,因此维持NOS与NO的平衡对植物体来说至关重要。水分胁迫下植物释放的NO与乙烯有着较为复杂的关系Magalhaes等,2000。干旱胁迫减少拟南芥NO和乙烯的释放,溺水则增加乙烯的释放和NO的产生。在这些情况下NO是通过NR途径产生的,与NOS无关,因为NOS的抑制剂L-NNA对NO的释放无影响,而NR缺失的突变体只产生少量的NO。使用NO气体处理可使植物大量释放乙烯,说明NO参与了乙烯的合成诱导,而乙烯也可能与NO的产生有关,因为乙烯不敏感突变体ell -,和乙烯过量合成突变体eto只产生少量的NO。干旱条件下,植物合成的ABA能通过一系列复杂的信号级联机制诱导气iL关闭,在此过程中可以检测到豌豆叶片中NO释放量的增加Leshem和Haramaty,1996,1997。在拟南芥细胞中,NR介导的NO合成对于ABA诱导的气孔关闭是必需的。这都表明N0可能是植物中介导ABA诱导气孔关闭的关键信号分子Nejll等,2002;Garcia等,2002;Desikan等,2002,NO平[/ABA可以各自独立诱导
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