足球比分直播

兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf

返回
兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf_第1页
第1页 / 共45页
兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf_第2页
第2页 / 共45页
兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf_第3页
第3页 / 共45页
兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf_第4页
第4页 / 共45页
兔MC4R和DKK1基因的多态性与其与经济性状的关系分析.pdf_第5页
第5页 / 共45页
点击查看更多>>
资源描述:
,◆、,k口’,.~目 录中文摘要.1Abstract.3前言。5日Ⅱ吾..51.1 SNPs检测技术进展51.1.1 Taq.man探针技术51.1.2入侵者分析61.1.3分子信标技术61.1.4动态等位基因特异性杂交71.1.5基因芯片技术.81.1.6直接测序法。81.1.7高分辨率溶解曲线技术.91.2微卫星检测技术研究进展lO1.2.1从已知数据库中查找微卫星标记lO1.2.2基于PCR的微卫星标记分离方法..1 01.3家兔分子遗传研究进展..1 01.4 MC4R基因的研究进展..121.5 DKKl基因的研究进展..131.6本研究的目的及意义。15试验材料与方法162.1试验材料.1 62.1.1试验动物和样品采集.162.1.2试验材料培育过程..162.1.3试验数据收集..1 72.1.4试验主要仪器设备l 82.1.5试验主要试剂及配制.182.2试验方法192.2.1兔耳组织基因组提取与检测..192.2.2兔MC4R基因组HRM分析202.2.3兔MC4R基因数据统计分析..202.2.4兔DKKI基因引物设计及PCR扩增检测2l2.2.5兔DKKl基因突变位点检测222.2.6兔DKKI基因数据统计分析.23结果与分析243.1兔耳组织提取基因组DNA结果243.2 MC4R基因HRM技术分型结果.243.3 MC4R基因测序结果253.4 MC4R基因各基因型在不同配套系中的频率分布..253.5 MC4R基因在不同配套系内的遗传变异273.6 MC4R基因多态性与兔屠宰性状的相关性.283.7 DKKl基因引物扩增结果293.8 DKKI基因丙烯酰胺凝胶电泳检测结果293.9 DKKI基因多态性与兔被毛性状的相关性.30讨论..3 l4.1 MC4R基因试验群体的选择3l4.2高分辨率熔解曲线技术检测基因突变位点3l4.3 MC4R基因多态位点的筛选与基因型鉴定3l4.4 MC4R基因多态性分析324.5各配套系对肉兔屠宰性状的影响324.6肉兔MC4R基因多态性及其与屠宰性状的相关性334.7用丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术检测DKKI基因334.8 DKKl基因多态性与被毛性状的关系..34结论..35参考文献..36致谢44攻读学位期间发表论文情况..452一以、,■9‘.山东农业大学硕I学位论文中文摘要屠宰性状和被毛性状是兔重要的性状,与其经济价值有重要的关系。兔MC4R基因和DKKl基因是分别与其屠宰性状和被毛性状相关的基因。黑素皮质素受体4melanocortin一4 receptor,MC4R基因是目前5种已经被发现的黑素皮质素受体基因之一,属于跨膜G蛋白偶联受体家族。研究发现MC4R是参与能量平衡和体重、·调控采食的关键的信号物质之一。DKKl是DickkopfDkk家族的一员,属于Wnt信号途径拮抗物,而Wnt信号则是羽毛、头发毛囊诱导所必须的,因此DKKl与动物毛囊发育有这重要的相关性。本文研究了兔MC4R基因和DKKI基因的多态性及其与经济性状的相关性,目的在于寻找与兔经济性状相关的分子标记,从而为兔的遗传育种提供一种新的途径和方法。本研究采用高分辨率熔解曲线High Resolution Meltanalysi,HRM技术对康大肉兔配套系肉兔群体,共计418例样本的MC4R基因进行多态性检测,其中康大1号肉兔135只、康大2号肉兔137只和康大3号肉兔146只,并对该位点多态性与肉兔的屠宰性状进行相关性分析。采用丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术相结合的方法检测康大肉兔配套系DKKI基因,并分析该基因多态性与兔被毛性状的相关性。结果表明1康大l号,康大2号,康大3号肉兔的PIC数值分别为0.3719、0.3741和0.3663,’ 均大于O.25,小于0.5,三个配套系肉兔均为中度多态。康大l号和康大2号肉兔均处于Hardyweinberg平衡胗O.05,而康大3号肉兔分布则显著偏离了Hardy-weinberg平衡尸O.05。AA和GG基因型肉兔在背腰重性状上差异显著PO.05。康大2号三种基因型肉兔在宰前活重、前腿重和全净膛率三个屠宰性状上均差异不显著尸O.05。康大3号从和GG基因型肉兔在宰前活重性状上差异极显著尸O.05。相同基因型肉兔在宰前活重、前腿重、后腿重和背腰重4个屠宰性状中康兔MC4R和DKK]基因的多态性及其与经济性状的关系研究大1号肉兔均高于康大2号和康大3号肉兔数值。3用丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术相结合的方法检测兔DKKI基因,发现两种基因型,但这两种基因型在皮张面积、毛长、毛密度、光泽度和平整度5个和兔被毛性状相关的性状上均差异不显著.尸O.05。关键词康大1号肉兔康大2号肉兔康大3号肉兔Mc4R基因;DKKl基因经济性状2山东农业大学硕士学位论文AbstractSlaughter traits and wool traits are important traits in rabbits,and its economic value hasan important relationship.Rabbit MC4R gene and DKK l gene is respectively slaughter traitsand wool trait related gene.The melanocortin 4 receptormelanocortin-4receptor,MC4R.gene is has been found to be one of the melanocortin receptor genes,is a transmembrane Gprotein-coupled receptor family member.The research has proved that MC4R is involved inthe regulation of food intake,body wei曲t and energy balance in the key signal substances.DKK I is a member of the DickkopfDkkfamily,the antagonists of Wnt signal pathway,andthe Wnt signalling pathways is hair,feather follicles induced must,SO DKK 1 has an importantcorrelation in animal hair follicle development.This paper studies the rabbit MC4R gene andDKK I gene polymorphism and its association with economic traits,to looking for in rabbitswith molecular markers related to the genetic breeding of rabbits,and provides a new way and.This study USeS high resolution melting curveHigh Resolution Meltanalysi,HRMtechnology detected Kang da 1 rabbit 1 35,Kang da 2rabbit 1 37and Kang da 3 rabbit 1 46,atotal of 4 1 8samples of the MC4R,and analysis the site of mutation、析tIl rabbit slaughter traitconcision.Using acrylamide gel electrophoresis and silver staining technique combinings to detect the rabbit DKK I gene microsateilite haarkers,and analied the microsatellitemarker with trait correlations in rabbit WOOl traits.The results as follows1The No.I,No.2,and No.3rabbit’S PIC values were0.3719,0.3741 andO.3663,both of them is greater than 0.25,less than 0.5,three varieties of meat are moderatepolymorphism.The No.1 and No.2are at the Cornell University in rabbit Hardy WeinbergbalanceP0.05,but the No.3rabbit’S distributions deviate significantly from HardyWeinberg equilibriumP0.05.The 2AG and GG genotypes of meat兔MC4R和DKKI基因的多态性及其与经济性状的关系研究rabbit in the hind heavy traits significantlyP0.05.AA and GG genotypes of rabbit in the back waist weight trait differencesPO.05.The 2number of three genotypes of rabbit in body weightbefore slaughter,forelegs and whole net thorax rate three slaughter traits have no significantdifferenceP0.05.The 3AA and GG genotypes of rabbit in body weight before slaughtertraits had extremely significant differenceP0.05.The same genotype in body weight before slaughter,legs,back andwaist heavy heavy4 slaughter traits and 1 rabbits were higher than those of the 2and the3rabbitnumerical.3using acrylamide gel electrophoresis and silver staining technique combinings for detection of rabbit DlⅨ1 gene,found in two genotypes,but the two genotyl∞S inthe skin area,long hair,hair density,gloss and smoothness of 5and rabbit hair traits related totrait have no significant differencePO.05.● ●Keywordskang da 1 rabbit;kang da 2 rabbit;kang da 3 rabbit;MC4R gene;DKKlgene;economic traits4■-山东农业大学硕士学位论文1.前言养兔业作为新兴的养殖产业之一,属于畜牧业中的重要产业。目前,对兔的研究较少,尤其是有关分子遗传的研究非常少,对与经济性状有关的基因及其分子标记的研究在国内更是少见报道。因此对我国兔的遗传分析,尤其是进行从分子水平的研究以便于在系种利用及实际生产方面得到提高的研究更是至关重要。从DNA分子水平的研究来揭示我国兔系种的遗传现状,弄清新培育肉兔配套系在分子水平上的遗传多样性,从而对新培育配套系的遗传特点进行系统评估,以此获得我国兔系种资源遗传背景的第一手资料,为我国兔系种的合理保护及科学利用提供真实而可靠的依据。为了向抗病、高效、高产、优质的畜牧产业临近,为了保护人们赖以生存的生物多样性,对兔作更加深入的、更加广泛的、更加全面的研究,尤其是从DNA水平来进行的研究已经势在必行。1.1 SNPs检测技术进展’在染色体水平上由于单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性,被称为单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism,SNP,它主要包括四种形式,单碱基的插入及缺失、转换、颠换。单核苷酸多态性属于第三代遗传标记,第一、第二代标记分别为RAPD标记、和SSR标记。单核苷酸多态性众多优点,如数量多、分布广泛、遗传稳定性高和检测快速等。自从单核苷酸多态性被提出后,研究人员就在不断的摸索筛查单核苷酸多态性的方法,本文就近年来出现的应用较为广泛的检测方法进行介绍。1.1.1 Taq-man探针技术该技术又被称为核酸外切酶法,主要原理是,PCR过程中和PCR之后会产生不同的荧光信号,据此来区分等位基因类型,从而进行单核苷酸多态的检测。在该PCR反应过程中除了具有2个传统的PCR引物以外,还具有1个特异性的Taq.marl探针。荧光基因团和淬灭基因团分别标注在该等位基因特异性的Taq.man探针的3’端和5’端。当该探针与目标序列间存在错配的时候,探针与目标序列结合的紧密程度就会减少,TaqDNA聚合酶的切割活性也会相应减少,从而荧光释放量也会相应减少,据此就可以区分辨出突变DNA链和正常DNA链。Taq.man探针技术的优点是操作简便,在PCR反应过程后不需要进行沈脱操作,从而提高了检测速度并减少了试验污染的可5兔MC4R和DKK基因的多态性及其与经济性状的关系研究能性,缺点是该技术的敏感性容易受到Taq酶活性的影响,在设计探针的时侯需要特别注意PCR反应的扩增效率,并且探针设计的成本较高。AA /””” . /’’ ; CC .../’.Ac 多/. ●l一 · j. ,., j二 / 一一/L一 J, ..一一‘ -.p一i AC ≠二 _ .,。’。‘AA .... ‘ CC /‘‘ ‘ ’ ‘. · ij ,’ ;| /一 · -‘L J一’ t .· 一..一一一“~··.,二··..·.一.图l不同基因型对应的荧光信号曲线Fig.Fluorescence signal CUI VC ofdifferent genotypes1.1.2入侵者分析在该项技术的每一个反应体系中,均含有一条位于待测SNP位点上游的入侵探针、一对等位基因特异性探针和特殊的内切酶。当等位基因特异性探针与目标序列完全互补时,则该等位基因特异性探针与入侵探针的3’端会在SNP位点处发生重叠,此时内切酶就能识别,然后切除该结构,并释放出尾序列,该为序列为等位基因所特有,在被切除的尾序列的5’端上带有该等位基因特异性的荧光标记,它与淬灭剂分离,之后会释放出荧光而被检测到。若等位基因特异性探针在SNP位点处存在错配,就无法形成重叠结构,因而不发生切除反应,也就无荧光发出,最后通过检测荧光信号来区分等位基因的类型Lyamichev et a1.,1999。引物入侵技术可以不依赖于PCR扩增,而直接从基因组DNA进行SNP检测,但对基因组DNA的需要量较大Fors et a1.,2000;Rao盯a1.,2003。采用PCR扩增产物作为反应底物可以降低基因组DNA的需求量Mein et a1.,2000,在固相中进行入侵反应,可以进一步减少基因组DNA需求量Wilkins et a1.。1.1.3分子信标技术该项技术是由Tyagi et a1.在1996年研究并建立的。其基本的原理是分子信标是一个U型单链寡核苷酸探针,内部有部分序列是呈互补配对,在探针的两端分别带有连接在5’端的荧光素和连接在3 7端的淬灭剂。因为荧光只有在荧光素与淬灭剂之间达到一定6山东农业人学硕士学位论文的距离时才会产生,所以探针与目标序列在互补之前,因为荧光素和淬灭剂之间空靠得很近而并不会产生荧光。而当探针与目标序列进行完全互补配对之后,荧光素与淬灭剂因距离拉大而发生荧光;而当在探针与目标序列之间发生错配碱基的时候,则不会发生荧光图1.2,同时可以通过标记不同颜色的荧光染料来达到同时检测多个SNP的目的Tyagi et a1.,1996。该技术具有操作简单、灵敏度高、特异性强Tyagi et a1.,1996,可对核酸进行实时定量测定Whitcombe et a1.,1999;孔德明等,2003,甚至可以用于活体分析等特点,使其不仅在生物学研究中有着广泛的应用,而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色Soko et a1.,1998;MatSuo et a1.,1998。冒八、。/0 RMolecular Target DNABeacon IPCR productsM.惚,match图2分子信标技术检测SNP的原理Fig.2 Principle ofmolecular bcac,onfor genotyping SNP1.1.4动态等位基因特异性杂交动态等位基因特异性杂交Dynamic allele S1eCific hybridization,DASH是由Howellet a1.在1999年研究并建立的,其原理是首先在较低温度下将对一个等位基因具有特异性的标记有荧光染料的探针与目标序列杂交;然后在稳定加热的条件下持续测定互补双链所发出的荧光强度,并监测其与反应系温度之间的关系曲线;当温度达到变性温度时,荧光强度迅速减弱;存在错配碱基的互补双链的变性温度低于不含错配碱基的双链;这样就可以通过测定互补双链的变性温度来判断互补双链中是否含有错配碱基该技术的关键是动态加热和DNA变性的一致检测,比以往的动态等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术ASOH简便,同样能够准确的检测出SNP的所有突变型Prince et a1.2001。针对先前失败的实验重新设计PCR扩增引物,减少二聚体的影响,以提高PCR产物质量,这种精益求精的设计方略得到的结果显示DASH能够有效的检测出几乎所有的7
展开阅读全文
收藏
下载资源

加入会员免费下载





足球比分直播