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兔胚胎干细胞与分泌液在动物创伤模型上初步应用.pdf

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本研究由国家自然科学基金编号3 1001 096提供资助万方数据目录摘 要.11.文献综述..3l-1畸胎瘤干细胞研究概况31.2早期胚胎来源的ESCs研究概况..41.2.1小鼠胚胎干细胞的研究进展.41.2.2人胚胎干细胞的研究进展.51.2.3兔胚胎干细胞的研究进展..61.3胚胎干细胞生物学特性71.3.1胚胎干细胞形态和生长特性.71.3.2胚胎干细胞自我更新能力及全能性.71.3,3胚胎干细胞表面抗原标志一71.4胚胎干细胞的治疗..71.5胚胎干细胞治疗存在的问题81.5.1胚胎干细胞分离提纯难度大。81.5,2胚胎干细胞异常分化.81.5.3胚胎干细胞本身的遗传不稳定性.81.5.4胚胎干细胞的免疫排斥.91.6干细胞培养液的治疗.92.引言.103.材料与方法..113.1试验材料113.1.1试验动物1l3.1.2主要试剂113.1.3主要仪器设备1l3.1.4主要溶液的配制123.1.5培养液配制133.2试验方法133,2.1饲养层制备133.2.2兔胚胎的获取和培养133.2.3内细胞团分离、离散和培养143.2.4兔胚胎干细胞分离、传代和冻存143.2.5兔类ES细胞培养液的提取143_3试验动物与分组143.3.1构建日本大耳白兔软组织创伤模型153.3.2兔胚胎干细胞培养液静脉注射大白兔血常规的检测153.3.3构建日本大耳白兔眼部组织创伤模型153.3.4构建日本大耳白兔烧伤模型153.3.5构建大鼠皮肤组织缺损创面模型153.3.6正常动物背部解剖和组织学结构164.试验结果..174.1体外培养兔胚胎干细胞的生长及形态学特征..174.2注射胚胎干细胞对大白兔创伤的影响..17万方数据4‘3注射兔胚胎干细胞培养液对大白兔创伤的影响..194.4在大白兔创伤处注射胚胎干细胞和注射兔胚胎干细胞培养液比较一204.5静脉注射兔胚胎干细胞培养液观察大耳白兔血常规和温度的变化。214.6兔胚胎干细胞培养液对眼睛炎症的影响224.7注射兔胚胎干细胞培养液对兔烧伤的影响..234.8注射兔胚胎干细胞培养液对大鼠组织缺损创伤的影响..245.讨论..166.结论~28参考文献.29中英文缩略词对照表一33英文摘要..34作者简介36万方数据兔胚胎干细胞及培养液在动物创伤模型上初步应用摘 要本研究旨在体外分离培养兔胚胎干细胞,初步研究兔胚胎干细胞对软组织创面是否具有促愈作用,为兔胚胎干细胞在创伤修复中的应用提供实验基础;探讨兔胚胎干细胞分泌物在体外对动物机体创面的愈合作用探讨兔胚胎干细胞分泌物在不同种属之间是否存在特异性以及对待不同的创伤是否有促进愈合的作用,为兔胚胎干细胞培养液在创伤修复中的应用提供实验基础。试验方法、结果和结论如下1.兔胚胎干细胞的分离、传代选择自然发情母兔与公兔自然交配,配种后90h手术冲胚。对原代培养采取酶消化法,对细胞形态及变化进行观察,取生长良好的兔胚胎干细胞接种在饲养层上,在38。C、5%COz培养箱中继续培养。2.兔胚胎干细胞培养液的提取当ES细胞传代稳定,开始使用胰酶消化传代法,即吸去培养液。此时把吸去的培养液收集起来装入到离心管里进行离心4000rpm*5分钟抽取上清液。将上清液一20。C冻起来3.构建日本大耳白兔组织缺损创面模型4.构建日本大耳白兔眼部组织创伤模型5.构建日本大耳白兔烧伤模型6.构建大鼠软组织缺损创面模型通过实验得到如下结果1、在日本大耳白兔组织缺损创面模型中,注射兔胚胎干细胞的右侧伤口和没有注射兔胚胎干细胞的左侧伤口比较,右侧的伤口愈合速度要快。注射兔胚胎干细胞的右侧伤口愈合速度和注射兔胚胎干细胞培养液的左侧伤口比较,两者愈合速度没有明显的区别。2、在日本大耳白兔眼部组织创面模型中,滴注兔胚胎干细胞培养液的右侧眼睛和没有滴注兔胚胎干细胞培养液的左侧眼睛比较,右侧眼睛的炎症反应消退的快。3、在日本大耳白兔烧伤模型中,注射兔胚胎干细胞培养液的右侧伤口和没有注射兔胚胎干细胞培养液的左侧相比较,右侧的伤口愈合速度要快。4、在构建大鼠软组织缺损创面中,注射兔胚胎于细胞培养液的右侧伤13和没有注射兔胚胎干细胞培养液的左侧伤口比较,右侧的伤口愈合速度要快且没有出现排斥反应。通过实验得到的结论挑破透明带法和胚胎分割法得到的胚胎容易贴壁和增值,能够分离得到兔类胚胎干细胞兔胚胎干细胞能够加速创伤的愈合利于动物临床的使用;兔胚胎干细胞培养液易于收集,临床应用便利,其有刺激组织正常细胞的再生,抑制受损细胞的凋亡,利于组织创面的愈合万方数据兔胚胎干细胞培养液不存在种间的差异,不会造成异种动物的排斥,有利于动物临床上创伤的应用。关键词 兔胚胎干细胞;兔胚胎干细胞培养液;创伤;愈合2万方数据1.文献综述人们对干细胞的认识在不断的深入,随着人类胚胎干细胞的建立和体细胞动物克隆技术的成功,人类在不断的完善干细胞的相关技术。胚胎干细胞embryonic stem cells,ESCs是由原始生殖细胞Primordial germ cells,PGCs或早期胚胎内细胞团Inner cell mass,ICM经体外分化抑制培养而筛选出的一种具有多潜能性,且能在特定条件下分化为各种成体组织或胚外组织的的一类细胞[I.6】。1981年,英国剑桥大学Evans和Kaufman首次从小鼠延迟着床的胚泡中成功建立起稳定的小鼠胚胎干细胞mouse embryonic stem cells,mESCs系。1998年,美国威斯康星大学的Thomson等人13l采用与I 7年前Evans建立mESCs系大体相同的方法获得人胚胎干细胞human embryonic stem cells。hESCs系。兔作为一种实验室动物模型,在研究人生理疾病方面具有很多优点。和小鼠相比其不仅可以在生理操作上更容易因其个体大。而且和啮齿类动物相比兔子的系统发育更接近于灵长类。目前,兔已经被用于研究人类的血管疾病在发病的血液动力学测定方面有关中枢神经系统障碍的研究;有关脂蛋白新陈代谢异常情况的研究;心肌病的研究;及对肺有影响的生理学113.15】。细胞疗法是近年来出现的以正常、具有功能的细胞替换有缺陷或病损的细胞方法针对多种疾病治疗的新政策,其目的是替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能。细胞疗法中应用最多的靶细胞就是各种干细胞,本实验通过研究胚胎干细胞及其培养液在动物创伤的治疗效果来进一步说明胚胎干细胞的治疗。1.1畸胎瘤千细胞研究概况ESCs研究可追溯到上世纪五十年代小鼠畸胎瘤干细胞Embryonic carcinoma cells,ECCs的发现。畸胎瘤通常出现在卵巢或睾丸,它是一种近交系小鼠机体内生殖腺早期生殖细胞异常增殖形成的肿瘤。1954年,Stevens首先报道了129品系小鼠睾丸良性畸胎瘤的发病率【21】;Solter和Stevens在1970年首次将小鼠早期囊胚移植到睾丸和肾脏部位使其产生畸胎瘤,从中分离出小鼠畸贻瘤干细胞[22-23】。这项研究指出了胚胎和肿瘤细胞发生的紧密关系并表明胚胎能够发育成畸胎瘤;在1972年的时候,研究人员首次建立ECCs系,该系的细胞是从附植前胚胎异位移植产生的畸胎瘤中分离克隆细胞的,然后将该细胞重新注射到小鼠体内后,形成具有多种分化细胞的畸胎瘤,该次实验第一次证明ECCs具有多向分化的潜能[241;1975年,有报道称ECCs在体外可以形成类胚体Embryiod boay,EB[251。到1981年,已经建成了5株染色体数目正常的ECCs系建。从畸胎瘤的发现到其建系,人们发现绝大多数ECCs在体外传代后核型不稳定【26】,部分嵌合体早期易形成肿瘤,有些早期表现正常的胚胎,至成年期又易出现恶性肿瘤【27】,此外,ECCs形成生殖嵌合体的能力很低【冽。这些不足限制了万方数据ECCs在遗传操作中的应用,促使人们去寻找一种更有效的多潜能性干细胞作为遗传物质的载体,用以稳定的研究胚胎发育。于是人们开始了从早期囊胚分离ESCs的研究。1.2早期胚胎来源的ESCs研究概况畸胎瘤能够通过异位移植的方法人为诱导产生,因此科学家推测可能直接从囊胚中获得多能干细胞。1981年,Evans和Evans分别成功在体外培养出mESCs,该细胞具有无限自我更新和多向分化潜能,并且在传代的过程中能够保持稳定的二倍体核型,在适当的诱导条件下,能够分化成包括生殖细胞在内的所有成体细胞,该试验的成功对ESCs系的建立具有里程碑的意义,在此试验的基础上,科学家们相继建立了多个物种的ESCs系或类ESCs系。从动物早期胚胎的卵裂球、囊胚内细胞团细胞分离的ESCs建系,被认为是继“人类基因组计划”之后,生命科学上的又一革命性进展。其最大的特点是具有发育上的全能性或多能性,可以进行无限繁殖、冷冻保存及进行基因遗传的操作。并且人们已经从ESCs诱导分化出生殖细胞、神经细胞、肌细胞、间充质干细胞等,并可进一步研究机体所有组织、器官的发育过程。因此早期胚胎来源的ESCs是研究哺乳动物早期胚胎发育基因表达调控、了解人类某些疾病的发生发展机制等发研究的一个理想的系统模型和实用的生物学,且在过去的三十年里,科学家们以mESCs作为研究工具,在胚胎发育、信号转导、细胞周期调控等研究领域取得了巨大的研究进展。下面主要对mESCs、hESCs和rESCs的研究进展做介绍。1.2.1小鼠胚胎干细胞的研究进展Evans等人在1981年首次分离到mESCs系【l】,其使用的方法是通过129品系小鼠延迟着床囊胚培养在STO细胞饲养层上的技术实现的。在1981年,Martin用免疫外科法分离ICM,成功分离得到mESCs系【2】通过利用ECCs条件培养液对囊胚进行培养的方法。三年后Bradley等把mESCs通过嵌合体证实ESCs的全能性【29】,该实验是通过小鼠囊胚获得生殖系嵌合体小鼠来验证的。随后。人们对mESCs的培养体系和分离过程进行了提升,慢慢建立了许多mESCs系,其培养特征总结下可以有以下6个方面①小鼠胚胎成纤维细胞Mouse embryonicfibroblasts,MEF可以作为培养mESCs的饲养层,同时发现小鼠胚胎成纤维细胞还可以作为猴子、人类等其他动物的干细胞饲养层【3,8q2]。②在试验过程中发现并确认白血病抑制因子Lzukemia inhibitor factor,LIF是体外维持mESCs未分化状态的重要细胞因子【30.31],并且科学家在无饲养层培养体系下,在培养基中添加LIF培养小鼠ICM建立了mESCs系[32】。③通过改进传统方法可从囊胚前卵裂球获得mESCsE33-35l。④所得mESCs系可用于遗传修饰。Chung等人在2006年用活体动物组织取材技术得到单细胞胚胎卵裂球,在实验室培养后,建立起了7个滋养外胚层干细胞系,并且使用相同的方法建立了5-个ESCs系,同时他们将外源DNA导4万方数据入ESCs通过反转录病毒载体的方法,实验人员建立了一种以ESCs作为基因载体的转基因方法136】。许多别的研究人员也通过相似的方法证实了该研究通过把遗传修饰的ESCs注入宿主囊胚的方法产生转基因后代,并且通过将干细胞转基因技术与基因打靶、基因敲除结合的方法,这种方法将对小鼠基因组工程研究产生深远的影响【37】。⑤纤维连接蛋白是mESCs培养与自我更新的必要条件[38],如果在无饲养层培养体系下进行实验并且添加相应的细胞因子外。勘nESCs通过诱导可以定向分化成造血干细胞、皮肤细胞、神经细胞、胰岛细胞等分化系统,为细胞工程、组织工程提供了新的材料和来源,为人类细胞移植的治疗提供思路【a9l。1.2.2人胚胎干细胞的研究进展第一次培养出hESCs系【3】的是美国威斯康星大学的Thomson团队,他们通过免疫手术方法把囊胚外层的滋养层细胞给去掉,将得到的ICM接种至IJMEF上,培养一段时间后,ICM会贴在壁上并随着时间的推移逐渐形成细胞集落,接着人为机械的把形成的细胞集落分成几个小块,然后再次将这些小块接种到新的饲养层上让其进行传代。重复这个过程直到细胞能稳定的长期的hESCs系。hESCs在临床上具有非常广阔的应用前景。基于这个原因,很多国外的研究学者先后通过类似的方法建立了多株hESCs系,但是由于他们建系的方法不是一样的因此成功率相差也比较大,这可能与他们在建系过程中使用了很多不同来源的动物造成的,这里面包括动物的血清、不同的饲养层,培养液及不同的抗体,这些因素都能造成很大的结果差异,因此以上提到的方法不适合应用到临床上。因此,要想解决这种麻烦,我们就必须想办法使干细胞在无动物源性的培养体系中生存。因此,科学家和研究学者近些年来一。直都在围绕着饲养层问题和其相关的领域做了诸多的研究。1、利用血清替代品knockout serum replacement,KSR替代胎牛血清Fetal bovine serumFBS。2005年,Lee等人140]和Klimanskaya等分别报道利用添加KSR的培养基中分离建立新的hESCs;;2006年,Peng等[42】报道以MEF为饲养层,利用添力IKSR的培养液分离并获得新的hESCs,随后,KSR广泛用于hESCs的分离建系过程中【43’“】。2、建立人源细胞作为饲养层体系培养hESCs。与MEF相比,采用人源作为饲养体系的话既能避免动物性病原传播而且相对于MEF,人源细胞作为饲养层可以使细胞传代更长,这样便于稳定胚胎体系,筛选目的细胞系【45】。Richards等用人胎儿肌细胞、皮肤细胞及成人输卵管成纤维细胞分别作为饲养层,成功建立llESCs系,且长期培养后干细胞可保持未分化状态[46’471;Soong等报道称利用羊水间充质干细胞为饲养层可分离获得hESCs系【48】,相关试验也报道了人骨髓来源细胞、胎盘成纤维细胞等人源细胞饲养层可以支持hESCs建系。3、无饲养层培养体系培养hESCs。无饲养层培养体系的最大特点是能够减少或者消除饲养层细胞培养所带来的干扰与污染,从而能够更好地研究hESCs的生长和发育,为进一步试验提供更准各材料。无饲养层培养体系的组成要素有①细胞外基质②条件培养基或限定性培养基。2004年,Amitl49】报道了在无饲养层培养体系下,在培养液中添加适量的细胞因5万方数据子,如bFGF、TGF.B等,可长期保持hESCs所有特性。2010年,研究者Pakzad团刚50】报道称,将hESCs培养在以Metfigd、层粘连蛋白包被的培养皿,含有ROCK-抑制剂,碱性成纤维细胞生长因子basic fibroblast growth factor,bFGF的无饲养层条件培养液中,可获得核型稳定,且能够表达ESCs特性的hESCs系。2013年,Freitas研究小组【5I】将磁场纳米系统系统引用于hESCs的无饲养层培养体系中,获得相应的干细胞。同年,研究者证明在无饲养层培养体系下嵌合体玻连蛋白IGF-l蛋白支持hESCs体外培养【52】。hESCs的成功建系研究可以使这种永生化的细胞体外培养细胞作为发育模型帮助人们更好的认识胚胎正常发育进程,在研究疾病发生、早期流产的原因、胚胎老化的因素、药物筛选与新药开发方面、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。目前,利用干细胞移植技术已逐渐成为治疗白血病、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。hESCs作为最初的发育细胞,理论上可以定向分化成任何一种特定的细胞类型,这些定向分化的细胞可成为人类疾病治疗的各种替代种子细胞。原则上其能提供所有的自体失活细胞或者被破坏的疾病组织的细胞,但因人类疾病的复杂性及临床技术等方面的限制,hESCs替代临床治疗只限于几种常见的人类疾病上。但其依旧在治疗各种疾病上给人类带来了新的曙光。1.2.3兔胚胎干细胞的研究进展1993年,Graves等It6】从兔早期胚胎中分离得到兔的类ESCs,继代培养一年以上,仍保持正常核型,并且体外分化试验形成类胚体。1996年,Du等【53】将能够在体外分化成的三胚层的兔类ES细胞经核移植后在体外培养后发育至囊胚。1998年,赖良学等[划通过对胚胎进行切割,分离到兔类ESCs,传至第7代,并用传至2代的ESCs获得一只皮毛嵌合兔。2005年,方贞州55】从新西兰兔,青紫蓝兔,长毛兔的囊胚中分离培养出rESCs,最早的一株新西兰rESCs已在体外培养1年以上,传代100多次,仍保持兔ES细胞的特征和稳定的核型。2009年,Intawicha等【19l从获得新西兰兔的ICM中获得rESCs。在rESCs体外培养过程中,由于兔囊胚独特的结构特征透明带较厚,透明带外还有一层胶膜,在体外培养时,囊胚虽然可以快速扩张,但极不容易从透明带中孵出。故在培养过程中,研究者们一般会将兔囊胚进行简单的处理。赖良学等对兔囊胚的研究发现,具膜整胚要体外培养4.5天才开始孵化,然后贴壁生长,而离散胚,切割胚,去膜整胚在体外培养48 h就可贴壁;曹君君[56】试验发现,未处理兔囊胚96 h贴壁率为0.00%,而去膜胚、切割胚、离散胚,96 h贴壁率分别为85.29%,86.71%,91.30%。李朝军等157】通过比较胚胎直接培养法、胚胎分割法和卵裂球培养法三种方式建立rESCs系,发现胚胎分割法最为有效,分离出的ICM易生长于饲养层细胞上,传代后并可生长出ESCs样的细胞克隆。所以,用ICM培养rESCs,胚胎需先去胶膜和透明带,或是通过分割方式离散胚胎,则可利于ICM的贴壁和生长。6万方数据1.3胚胎干细胞生物学特性1.3.1胚胎干细胞形态和生长特性各种哺乳动物的ESCs形态结构与早期胚胎细胞相似,即细胞体积小,核大,核质比高,细胞核显著,有一个或多个核仁,且具连续无限的增生能力。ESCs细胞质多为常染色质,细胞结构简单,细胞胞质内除大量游离的核糖体和线粒体外,其它细胞器较少。ESCs体外培养时,细胞堆积密集,细胞间界限不清晰。呈集落状生长,细胞克隆形态多样,多数呈岛状或巢状,细胞克隆和周围存在明显界限,形成的克隆细胞彼此界限不清,细胞表面有折光较强的脂状小滴,且在体外培养过程中可以保持稳定整倍体核型。1.3.2胚胎干细胞自我更新能力及全能性ESCs一旦成系后,在体外具有终生自我更新能力,完全不同于那些有限自我更新能力的祖细胞。并且在可以保持高度增殖,能够在体外快速扩增,该特性对干细胞的研究和应用具有重要作用。ESCs理论上能够分化为任何一种体细胞包括生殖细胞和参与生殖器官发育,在体内只有附植前胚胎细胞具有多分化潜能性。体外在一定条件下,ESCs可向特定细胞分化,并形成特定细胞分化类型。1.3.3胚胎干细胞表面抗原标志ESCs在灵长类上具有一系列特异性的表面标记。阶段特异性胚胎抗原Stage.SpecificEmbryronicAntigens,SSEASSEA.1,SSEA.3和SSEA-4是球形糖蛋白,能被单克隆抗体识别。它的表达在胚胎发育早期受到严密的调节。因此,它们是鉴定哺乳类ESCs分化的重要工具。并且它的表达具有种属特异性,例如小鼠和人ESCs的表面抗原存在种属差异性,小鼠ICM细胞和ESCs均表达SSEA-1,但不能表达SSEA一3或SSEA-4。人ESCs表达的抗原标志主要有SSEA一3,SSEA--4等,SSEA-4呈强阳性,SSEA.3呈弱阳性而SSEA.1为阴性。且最近的研究发现,哺乳动物ESCs均有表达SSEA.1的特性,其表达由白介素.6特别是LIF来介导维持。1.4胚胎千细胞的治疗干细胞治疗指的是将干细胞单独提取出来后通过皮下注射或者静脉注射的方法将干细胞注入体内,从而达到治疗和修复受伤组织的目的。干细胞理论上可以分化成任何一种组织,7万方数据
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