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外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合与表达.pdf

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ABSTRACTDuring construct ion of highefficiency and broad’spectrumBacillius thuringiensis engineered strain,the introduction ofhigh’copy number plasmid resulted in a significant decrease inthe spore number and retardance of sporulat ion,and as aconsequence,negatively affected the toxicity of Bacilliusthuringiensis.It needs plentiful energy during sporulation of最thuringiensis.It would consume a mass of energy to repl i cateand maintain higy copy number plasmid.So the sporulation of显thuringiensis is retarded.Besides,unstable singlestrandedDNAssDNAalways ed in the course of Bacillius plasmidreplication,which will lead to removal of the plasmid andheterologous gene.The object of thi s project is to integrateheterologous gene into the chromosome of丑thuringiensis tosolve these problems and construct highefficiency Btengineered strain that can stably express heterologous gene.The trigger factor gene located on the chromosome of最thuringiensis was chosen as the integration site.The TriggerFactor protein has been characterized in Bacilliusthuringiensis acrystal l i ferous strain XBU001 via proteomicss in our laboratory.By analyzing the homology of triggerfactor gene sequence from several strains of B.thuringiensis,two pairs of primers TFIF/TFlR and TF2’F/TF2‘R based onconservat ive region were synthes i zed.And the 5’ end and 3’ endof trigger factor gene were amplified as the homologous arms.An integrative plasmid pKTFl2 was constructed by cloning thethe homologous arms onto plasmid pKSV7,a temperature sensitiveshuttle vector.An engineered strain KCTFl2 containing cryldcⅢgene in its chromosome was constructed via this integrativeplasmid pKTFl2.Several characteristics of KCTFl2 has been compared withrecombinant strain HTX42 harboring a high’copy number plasmidand XBU001,including growth curve,stabi l i ty of heterologousgene,morphology of crystals and cells,spore number,expressof CrylAc protein and insecticidal activity.The resultsdemonstrated that sitespecific integration of crylAc in thechromosome di d not affect the normal growth of XBU00 1.TheKCTFl2 could stably express crylAc gene and produce bipyramidcrystal s.When compared wi th HTX42,KCTFl 2 has the meri t ofadvanced sporulat ion and an increase in spore number.CrylAcbegan to express after 12 hours of incubation and reached itsmaximum after 20 hours of incubation in KCTFl2 strain,whilein HTX42 strain CrylAc began to express after 18 hours ofincubation and reached its maximum after 28 hours ofincubation.The insecticidal activity of CrylAc proteinproduced by KCTFl2 and HTX42 to the second instar lavea ofttelicoverpa armigera did not show significant difference.The sitespecific integration proved to be a good approachto construct resistance genefree B.thuringiensis engineeredstrain that can stably express the heterologous gene. Andresistance gene in B.thuringiensis engineering strain can beeliminated by the temperature sensitive plasmid pKSV7,whichcan avoid the risk of environmental release.Key wordsBaciniuS thuringiensis;sitespecific integrationhomologous recombinat iontrigger factor gene crylAc geneⅣ缩略表Amp‘ Ampicillin resistance geneAPSbpBsBtCm‘EBEDTAErmrICPSLCsoPAGEPBSPCRSDSSGTeMEDTrisAmmonium persulfatebase pairBacillus subtilisBacillus thuringiensisChloromycetin resistance geneEthidium bromideEthylene diaminetetraacetic acidErythromycin resistance geneInsecticidal Crystal Proteins50%lethal concentrationPolyacrylamide gel electrophoresisPhosphate.buffered salinePolymerase chain reationSodium dodecyl sulfateSucrose glycerol bufferN,N,N’,N -tetramethyl-ethlenediamineTris--hydroxymethyl-aminomethane氨苄青霉素抗性基因过硫酸铵碱基对枯草芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌氯霉素抗性基因溴化乙锭乙二胺四乙酸红霉素抗性基因杀虫晶体蛋白半致死浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲溶液聚合酶链式反应十二烷基硫酸钠蔗糖甘油缓冲液四甲基乙二胺三羟基甲基氨基甲烷湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名 钠落I I2卯6年b月12.日湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学.同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口,在年解密后适用本授权书。2、不保密团。请在以上相应方框内打“/“作者签名导师签名日期加嘲年b月t2日日期知眸‘够日外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达1.前 言1.1苏云金芽胞杆菌概论苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis,简称Bt为革兰氏阳性菌,广泛存在于土壤、昆虫尸体、蚕渣、蝙蝠粪便、仓库灰尘、海水、沙砾、落叶等各种生态环境中【1】。1901年日本学者石渡繁从患猝倒病的家蚕幼虫中分离到第一个产生晶体的芽胞杆菌。1909年Berliner从德国苏云金地方一家面粉厂染病的地中海粉螟中分离到一个相似的菌株,并正式定名为Bt[2l。4年后,一个叫克林诺的科学家发现,在这种细菌的细胞中可以形成方形或菱形的晶体,可惜这个发现并未被重视。直到40年后的1953年,一个叫汉纳的生物学家证明了这种晶体是有毒的蛋白质晶体,才揭示了粉螟死亡的原因。Bt的分类是细菌学家争论不休的问题之一,直至1J1957年在伯杰细菌鉴定手册中才正式列为一个独立的种,种以下又区分为不同的亚种。亚种的划分主要依据鞭毛抗原的血清型H.血清型【3】和生理生化特性的不同,后来由于无鞭毛亚种的出现,人们又采用了营养细胞的酯酶型作为辅助分类依据。据估计全世界已分离保存的Bt菌株已有60000多个,并且世界各国对Bt的筛选工作一直没有间断。目前有70个血清型矛1J84个亚种,其中12个血清型亚种来自于中国【4】。在19201930年代,Bt作为微生物杀虫剂主要用来防治玉米螟。1938年第一个商品制剂Sporeine在法国问世,从此拉开了Bt作为生物杀虫剂的序幕。现在证明Bt对鳞翅目Lepidoptera、双翅目Diptera、鞘翅目Coleoptera网、螨类Mites、同翅目Homoptera、膜翅目Hymenoptera、直翅目Orthoptera、食毛目Mallophaga昆虫,线形动物f-]Nemathelminthes、原生动物f]ProtozoadO某些有害种类都有作用【每71。已有数据表明Bt对16个目3000多种害虫有效。随着人们环保意识的不断增强,生物农药正在引起越来越多的关注。Bt1J剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜,易产生抗性等缺点,具有硕士学位论文选择性强、安全、原料简单等优点,在生物杀虫剂市场中所占份额也日益增加,广泛用于农林害虫的生物防治【8-101。1.2 Bt生物活性成分由于Bt能够带来巨大的经济效益和生态效益,引起了科学家们极大的兴趣,对其遗传机制、质粒谱、基因结构与功能、基因的表达调控、杀虫活性以及在环境保护应用等方面进行了大量研究,至今已经找到了十几种有着不同功能的生物活性成分。这些成分根据在细胞中的位置可分为两类,分泌到胞外发挥作用的活性成分,称为胞外因子;而置留在细胞内的活性成分或包涵体,统称为胞内因子。胞外活性因子有营养期杀虫蛋白vegetative insecticidal protein,简称VIP、几丁质酶chitinase、磷脂酶Cphospholipase C111】、溶血素hemolysin.【切、苏云金素thuringiensin113]、双效菌素Zwittemiein八即zwA因子12,141等,除了双效菌素不具有直接的杀虫活性外,其余的均有不同程度的杀虫毒力。其中最主要的是营养期杀虫蛋白和几丁质酶。VIP是指营养期表达的,易溶于水的可溶性杀虫蛋白。从Bt中克隆的营养期杀虫蛋白基因有vip3Aa、vip3Ab署nvip.S。生物测定结果发现VIP对小地老虎Agrotis ipsilon、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、甜菜夜蛾Spodoptera exigua,烟蚜夜蛾Heliothis virescens、美洲棉铃虫Helicoverpa zea、欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis等鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性【15.161。几丁质酶是最早从Bt中发现的可溶性胞外蛋白质类杀虫活性物质。Bt菌产生的几丁质酶对其杀虫活性有增效作用,在农业害虫防治中的存在着巨大潜力117]。Bt在整个生活周期当中还产生了许多胞内活性因子,其中杀虫晶体蛋白insecticidal crystal proteins,ICPs是Bt主要的杀虫活性成分。另外,胞内活性因子还有免疫抑制因子Aimmune inhibitor A,简称InA[131、肠毒素enterotoxin1181、辅助蛋白help protein1191、自身诱导物抑制蛋白autoinducer inhibitor,简称Aii[20l。这些生物活性成分的发现使得Bt具有更大的吸引力,科学家们对其研究也不断深硕士学位论文体【271。Bt中cryl基因的高效表达还与转录后mRNA的稳定性有密切关系。Bt基因转录的mRNA有比较长的半衰期,平均可达10分钟,至少是一般细菌mRNA平均半衰期的5倍【281。Wong矛lIChangt29】发现c秽1Aa基因的转录终止子为茎.环结构Stem.100p structure可作为一种正调节因子,可以防止3’.5’核酸酶的外切活性破坏转录的mRNA,从而增加了mRNA的稳定性【301。Bt编码产生的Cryl蛋白能组装成晶体,晶体有各种形状,Cryl为双塔形,原毒素聚合形成的晶体能有效的抵抗蛋白酶的降解。研究表明几种cryl基因转入大肠杆菌E.coli和枯草芽胞杆菌B.subtilis菌株中能直接聚合成具有生物学活性的包涵体,说明这些分子量为130~140kDa的Cryl蛋白能自发形成晶体,这主要是由于Cryl蛋白的C.末端富含半胱氨酸,从而容易形成二硫键构成晶体【311。CrylAc杀虫晶体蛋白是一种碱性蛋白,由1177个氨基酸组成,其分子量大小为133kDa。C端是亲水的部分,具有B.折叠的二级结构,主要用于维持伴胞晶体的形成;N端是疏水的部分,具有a.螺旋结构,是发挥特异毒力的功能区域【321。它具有3个结构域结构域I由1.290个氨基酸构成,含有3个反向平行的a.螺旋,结构域I与离子通道的形成有关;结构域II由291500个氨基酸组成,含有3个反向平行的B.折叠,这3个折叠连接排列形成B.棱柱折叠结构,参与毒素与受体的结合;结构域ⅡI由501~644个氨基酸构成,含有2个反向平行的B.折叠,C端包裹其中,结构域III也参与毒素与受体的结合,使毒素具有特异性【33.361图1.1。Bt CrylAc杀虫晶体蛋白能够对小菜蛾、棉铃虫等鳞翅目昆虫有特异的毒杀作用。当被昆虫摄食之后,在昆虫幼虫的肠道内经蛋白酶水解,转变为65.70kD带有N.末端的具有杀虫活性的毒性多肽分子。它可与敏感昆虫中肠上皮细胞表面的特异受体相互作用,诱导细胞膜产生一些特异性小孔,扰乱细胞的渗透平衡,并引起细胞膨胀甚至裂解,从而导致昆虫停止进食而最终死亡【3”81。外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达1.4外源抗虫基因蛋白酶抑制剂protease inhibitors,PI是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,普遍存在于植物、动物和微生物中。它的种类很多,按其性质可分丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂4大类【391。现在已从豇豆、马铃薯、番茄等植物中分离、纯化了多种蛋白酶抑制剂。1987年,Hilder等人首先成功地将印口基因导入烟草【删11,1993年莽克强等成功地将Cp口基因导入水稻,使水稻具有抗二化螟、三化螟的特性【421。蛋白酶抑制剂是植物体内天然的防御系统,可通过消化道进入昆虫的血淋巴系统,从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和免疫应答【43删。植物外源凝集素1ectin是含有1个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白【45】,它广泛存在于植物的各种器官中,尤以豆科植物的种子中含量最丰富。植物凝集素是一类具有特异性糖结合活性的蛋白,不同植物的凝集素对不同昆虫表现有毒性【12,删7】,并参与植物的防御反应。目前用于植物抗虫基因工程的植物凝集素基因主要有雪花莲凝集素GNA基因、豌豆凝集素P.1ec基因等。在植物基因工程中,凝集素主要用于植物的抗虫、抗菌、抗病毒。凝集素抗虫的作用机制可能是其特异性地结合到昆虫消化道围食膜的几丁质或上皮细胞的糖缀合物或糖基化的消化酶上,影响营养物质的正常吸收;同时还可能在消化道内诱发病灶,促进消化道内细胞的繁殖,使昆虫得病或引起拒食、生长停滞甚至死亡;另外凝集素也能微弱地与脂肪体、卵巢、血淋巴结合,破坏循环系统14引。淀粉酶抑制剂a.amylase inhibitor,a.AI在植物界中普遍存在,尤其在禾谷类和豆科作物中含量更高。淀粉酶抑制剂普遍抑制昆虫体内的a.淀粉酶,而对植物本身和细菌的a.淀粉酶不起作用。淀粉酶抑制剂杀虫机理是a.AI与昆虫的a.淀粉酶以11的分子比相结合形成EI复合物,从而抑制淀粉酶活性,使食入的淀粉不能正常消化,阻断昆虫主要的能量来源,同时刺激昆虫消化酶分泌过量,导致昆虫厌食而发育不正常或死亡【491。a.触是天然的抗虫蛋白,将它用于转基因抗虫,安全性好,已成为转基因作物的一个重要研究内容。1995年Hartmut硕士学位论文等将菜豆中aAI.1的基因成功转入两种豆科作物豌豆和豇豆,aAI.1蛋白高效表达,转基因植物具有明显的抗虫性【501。几丁质酶Chitinase可催化水解几丁质的B.1,4糖苷键生成N.乙酰.D.氨基葡萄糖NAG,它在植物病虫害防治及几丁质废物的转化和利用等方面具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视,有着广阔的前景[51-54】。关于几丁质酶杀虫活性的增效机制目前尚无定论。有假说提出昆虫中肠的围食膜的主要组成成分是几丁质,几丁质酶破坏了昆虫防止病原细菌和病毒侵染的天然屏障,有助于细菌及其产生的毒素侵染昆虫幼虫,加速了幼虫罹病的速度,提高了幼虫的死亡率【551。Huber等【561观察发现外源几丁质酶可以消化埃及伊蚊彳.aegypti的围食膜的实验支持了这种假说。除了上述几种在转基因植物中常见的的抗虫基因以外,目前研究表明,异戊烯基转移酶ipt,胆固醇氧化酶,阴离子过氧化物酶anionicperoxidase,色氨酸脱羧酶trypophan decarboxylase,“rDC等有关的代谢酶转到植物中,也使植物表现出一定的抗虫性I锅571。1.5 Bt的应用研究Bt自二十世纪初被发现以来,在害虫的防治中发挥了巨大的作用,是近年来研究最深入、开发最快速、应用最广泛的微生物杀虫剂。尤其是二十世纪八十年代以来,随着分子生物学理论及其技术的成熟和发展,对Bt的相关研究如杀虫蛋白基因的分离克隆、结构功能、诱变改造及其应用等方面更加广泛而深入,人们可以用基因工程的方法将克隆的cry基因进行遗传改良,构建不同功能的遗传工程微生物或培育抗虫植物新品种,从而给传统的植物病虫害生物防治注入了新的活力,显示了Bt更加广阔的应用前景。1.5.1 Bt制剂在农林害虫防治中的应用Bt很早就被人们用来作生物杀虫剂。1938年,第一个商品制剂Sporeine在法国问世。目前,Bt已发展成为国内外产量最大的微生物杀虫剂,占生物防治剂总量的95%以上,已有60多个国家登记了120
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