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维科生物制剂抗氧化活性物质的响应面优化与其在保障农产品品质安全上的应用.pdf

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上海海洋大学硕士学位论文 1 维科生物制剂抗 氧化活性物质的响应面优化 及其在保障农产品安全上的应用 摘 要 本文是探究以甜叶菊残渣为主要原料,提取其内抗氧化有效活性成分物质,通过提取方法的优化改进,达到降低提取能耗,提高产能的作用。通过实验设计,利用响应面法的优化并结合实际的实验操作,结果可得,传统水浴结合超声法 的最优生产工艺条件为 料液比为 116 g/mL,水浴提取时间为 107min,水浴提取温度为 93?C,超声辅助提取时间为 20min,在此条件下所得提取液对 DPPH 的清除率达 90.35±1.39。 而直接超声提取法所得最优生 产工艺是料液比为 124 g/mL,超声 时间 为 38min, 超声功率为 164W,在该条件下所得提取液对 DPPH的清除 率可 达 90.47±1.43 , 其主 要的 抗氧化 活性 物质 总 酚的得 率达16.14±0.36mg/g。 为证明 甜叶菊残渣中有效活性物质的实际经济价值, 初步探究以其为主要原料的新型纯天然的生物制剂 维科生物制剂,应用于蔬菜的保鲜及农产品大田试验的效果,初步研究结果表明,稀释的维科生物制剂对蔬菜的保鲜及品质的维持具有一定的作用。通过附加施用维科生物制剂的水稻、蓝莓以及鸡毛菜大田试验,并与大田试 验的空白组比较,不论是从产品的产量还是品质上统计,试验组都具有显著的提升,效果明显。 本研究为有效进行植物体内所含抗氧化有效活性成分物质的提取,对依据抗氧化有效活性成分物质作为实用价值制成的维科生物制剂在农产品领域等的更深入的应用探究奠定了基础。 关键词 维科生物制剂; 甜叶菊残渣;超声提取;响应面法 ;蔬菜保鲜;大田试验 万方数据上海海洋大学硕士学位论文 2 The Response Surface Optimization for Natural Antioxidant of WIC and Its Application to Ensure the Qualitative Safety of Agricultural Products Abstract This article is to explore the stevioside residue as raw material, extracting its antioxidant effective active ingredient, meanwhile to reduce energy consumption and increase production capacity through the of response surface ology to optimize extraction. By experimental design, optimization of the response surface and in combination with the actual experiments, the traditional water bath combined with the ultrasonic of optimal production conditions are as followsmaterial/water ratio 116 g/mL, water bath time 107 min, water bath temperature 93℃ and ultrasonic time 20 min. The DPPH scavenging capacity was 90.35±1.39 of repeation. Taking the actual operation into consideration on the ultrasonic , the optimal parameters were adjusted to material/water ratio 124 g/mL, ultrasonic time 38min and ultrasonic power 164 W, the average DPPH radical clearance rate reached 90.47±1.43 and total phenols was 16.14±0.36 mg/g of repeation. To prove the active substances in the stevioside residues have actual economic value, In order to preliminary inquiry the function of new pure natural biological agents, WIC natural biologicsWIC, which be producted with stevia as the main raw material. Appling to the preservation of vegetables and agricultural field experiments to prove that the dilution of WIC play a certain role in maintaining the fresh and quality of vegetables preservation. By providing the additional WIC to rice, blueberries and green vegetable field tests, the experimental groups have significantly promoted and obvious effect, whether it is from the product on the yield or quality of the statistics, through comparing with each blank groups during different field tests. 万方数据上海海洋大学硕士学位论文 3 This study to improve the extraction of antioxidant effective active ingredients in plants, and reflect the further value of WIC which is on the basis of the antioxidant effective active ingredients be applied in the field of agricultural products. This study act as a solid foundation in using WIC to the reality. KEY WORDS WIC Natural Biologics; stevioside residues; ultrasonic extraction; response surface ology; Preservation of vegetables; field tests万方数据上海海洋大学硕士学位论文 目录 摘 要 ............................................................................................................................... 1 Abstract .............................................................................................................................. 2 第一章 引 言 ................................................................................................................. 1 第二章 甜叶菊残渣抗氧化活性物质的超声辅助水浴提取工艺的响应面优化 ......... 4 2.1 材料与方法 ......................................................................................................... 4 2.1.1 实验试剂 ................................................................................................... 4 2.1.2 仪器与设备 ............................................................................................... 4 2.1.3 实验方法 ................................................................................................... 4 2.1.3.1 甜叶菊残渣生物活性物质的提取 ................................................. 4 2.1.3.2 甜叶菊残渣生物活性物质清除 DPPH 自由基能力的测定 ......... 5 2.1.3.3 数据分析 ......................................................................................... 5 2.2 实验结果 ............................................................................................................. 6 2.2.1 单因素对三种甜 叶菊残渣粉末样品 DPPH 清除率的影响 ................... 6 2.2.1.1 料液比对 DPPH 清除率的影响 ..................................................... 6 2.2.1.2 水浴提取时间对 DPPH 清除率的影响 ......................................... 7 2.2.1.3 水浴提取温度对 DPPH 清除率的影响 ......................................... 7 2.2.1.4 超声辅助提取时间对 DPPH 清除率的影响 ................................. 8 2.3 响应面实验设计优化工艺参 数 ......................................................................... 9 2.3.1 实验因素和水平的选择 ........................................................................... 9 2.3.2 响应面分析设计及结果 ......................................................................... 10 2.3.3 最 优 DPPH 清除率工艺参数的确定 ..................................................... 14 2.3 小结 ................................................................................................................... 14 第三章 甜叶菊残渣总酚物质的超声提取工艺的响应面优化 ................................... 15 3.1 材料与方法 ....................................................................................................... 15 3.1.1 实验试剂 ................................................................................................. 15 3.1.2 仪器和设备 ............................................................................................. 15 3.1.3 实验方法 ................................................................................................. 15 3.1.3.1 甜叶菊残渣生物活性物质的提取 ............................................... 15 3.1.3.2 影响提取效果的因素实验 ........................................................... 15 3.1.3.2 甜叶菊残渣生物活性物质清除 DPPH 自由基能力的测定 ....... 16 3.1.3.3 总酚得率的测定 ........................................................................... 16 3.1.3.4 数据分析 ....................................................................................... 17 3.2 实验结果 ........................................................................................................... 17 3.2.1 总酚标准曲线的建立 ............................................................................. 17 3.2.2 单因素对甜叶菊残渣水提取物 DPPH 清除率的影响 .......................... 17 3.2.2.1 料液比对 DPPH 清除率与总酚得率的影响 ............................... 17 3.2.2.2 超声时间对 DPPH 清除率与总酚得率的影响 ........................... 18 3.2.2.3 超声功率对 DPPH 清除率与总酚得率的影响 ........................... 19 3.3 响应面实验设计优化工艺参数 ................................................................... 19万方数据上海海洋大学硕士学位论文 3.3.1 实验因素和水平的选择 ..................................................................... 19 3.3.2 响应面分析设计及结果 ..................................................................... 20 3.3 小结 ................................................................................................................... 24 第 四 章 维科生物制剂 蔬菜保鲜作用的初探 ............................................................... 26 4.1 材料与方法 ....................................................................................................... 26 4.1.1 实验试剂 ................................................................................................. 26 4.1.2 仪器与设备 ............................................................................................. 26 4.1.3 实验方法 ................................................................................................. 27 4.1.3.1 维科生物制剂主要理化指标的测定 ............................................ 27 4.1.3.2 蔬菜主要理化指标的测定 ........................................................... 27 4.1.3.3 亚硝酸盐标准含量的测定 ........................................................... 27 4.2 实验结果 ........................................................................................................... 28 4.2.1 亚硝酸盐标准曲线的建立 ..................................................................... 28 4.2.2 维科生物制剂基本成分分析测定结果 ................................................. 29 4.2.3 维科生物制剂 DPPH 自由基清除能力的测 定 ..................................... 29 4.2.3 常见蔬菜保鲜实验结果 ......................................................................... 30 4.2.3.1 在保鲜期内各种不同蔬菜的失水率变化 ................................... 30 4.2.3.2 在保鲜期内各种不同蔬菜的亚硝酸盐含量变化 ....................... 31 4.2.3.3 在保鲜期内各种不同蔬菜的可溶性固形物变化 ....................... 32 4.2.3.4 在保鲜期内各种不同蔬菜的维生素 C 含量变化 ...................... 33 4.3 小结 ................................................................................................................... 34 第 五 章 维科生物制剂 对改善农产品品质初探 ........................................................... 36 5.1 材料与方法 ....................................................................................................... 36 5.1.1 试验试剂及试验基地 ............................................................................. 36 5.1.2 试验方法 ................................................................................................. 36 5.1.2.1 水稻试验方法 ............................................................................... 36 5.1.2.2 蓝 莓试验方法 ............................................................................... 37 5.1.2.3 鸡毛菜试验方法 ........................................................................... 37 5.2 实验结果 ........................................................................................................... 38 5.2.1 维科生物制剂的水稻试验结果 ........................................................... 38 5.2.2 维科生物制剂的蓝莓试验结果 ........................................................... 42 5.2.3 维科生物制剂的鸡毛菜试验结果 ....................................................... 43 5.3 小结 ................................................................................................................... 45 第六章 总结与展望 ....................................................................................................... 46 参考文献 ......................................................................................................................... 49 致 谢 ............................................................................................................................. 54 万方数据上海海洋大学硕士学位论文 1 第一章 引 言 食品工业、医药、化妆品等领域对抗氧化剂的要求主要集中在人工合成的抗氧化物质,且需求量并不低,但是人工合成抗氧化剂的安全问题一直备受关注,也有相关的动物实验表明其具有的一定的毒性和致癌的危险,因此,人们越来越追求抗氧化剂的天然性。国内外对天然食品抗氧化剂 的研究成熟度已经到达了一定的高度,而且成就斐然。 研究提取天然抗氧化剂的主要来源是中草药,研究表明黄芩、甘草、丹参等中含有大量的生育酚抗氧化活性物质 [1,2]。国内外研究还表明香辛料中富含的酚类及其衍生产物具有较强抗氧化性 [3-5],从迷迭香、生姜、百里香等常见香辛料中提取出的抗氧化活性物质比人工合成抗氧化剂 BHT 和 BHA 性能更强。另外还有大量国内外学者从大麦糠、油茶果壳、葵花籽壳和粕、油菜籽( Canola)粕等废弃植物类原料中开发提取出丰富类型的抗氧化活性物质,将原本需要废弃的物质综合利用起来,变废为宝, 创造了再生价值。 甜叶菊是一种菊科植物,又被称作“甜菊”、“糖草”,其作为巴西和巴拉圭地区固有的草本植物,被用于作为一种天然的甜味剂已有几个世纪之久。现今,甜叶菊已被发展成商业化,在日本、中国、韩国、英国、加拿大以及欧洲部分国家将由其提取的产物被大量商品化 [6-8]。其甜叶菊干叶中含有一种含量在 10左右的高甜度、低能量、无明显毒副作用的天然甜味剂 甜菊糖苷 [9]。国内外对甜叶菊的研究主要集中在其糖苷的提取和应用上 [10,11],对应用于甜菊糖苷的提取技术已从传统的水提法发展到离子交换树脂精制工艺 [12]、超高压工艺技术 [13],对于甜叶菊中多酚类物质等抗氧化活性成分的探讨鲜有报道 [14],而甜叶菊种抗氧化物质具有高效清除自由基的能力。 奚印慈联合日本专家学者们 [15]就甜叶菊抗氧化活性的研究早在二十世纪九十年代就取得了显著的成绩,并且通过研究证明干燥的甜叶菊茎、叶热水抽提物中的抗氧化活性物质对抑制鱼油、亚油酸的氧化具有明显的效果 [16];宁杰等人 [17]也通过实验利用的甜叶菊水提物证明其具有一定清除 DPPH 自由基的能力。由此可万方数据上海海洋大学硕士学位论文 2 推断,甜叶菊中含有的抗氧化活性物质的研究虽然不多,但是已足够证明其含有抗氧化活性 ,而对甜叶菊残渣系在生产糖苷后的残渣内是否还留存更多的具有强效的抗氧化活性物质,并且尝试将其合理科学地综合利用开发有效产品,这就显得具有更加广阔的研究前景。 相关的甜叶菊抗氧化活性研究的过程中,对于提取液的处理都采用热水水浴法提取 [16,17],李菁等人 [18]通过正交试验优化了水浴提取的条件,将有效成分的热水水提浸出率提高到 97。热水水浴提取特点在于提取过程中反应能够充分发生,最终能够达到理想的提取效率,但是热水水浴提取是一个大量吸收热量的反应过程,物料反应完全的前提下需要较高的反应温度和足够长的反应时 间,这势必能耗量大,以至于大大提高了热水水浴提取有效物质的成本。 本文对甜叶菊抗氧化活性成分清除 DPPH 自由基的能力着重集中在对甜菊糖苷残渣的研究。将甜菊糖苷残渣进行热水水浴提取,并结合超声波辅助,在此基础上,直接进行超声波条件的提取,提取过程不涉及提高水温的操作,对提取物进行 DPPH 清除率的对比测试,测定了甜菊糖苷残渣直接超声提取液中主要抗氧化活性成分酚类物质的含量,确定了甜菊糖苷残渣主要抗氧化的有效成分。 甜菊糖苷残渣中抗氧化活性成分的提取是废弃物综合利用方法之一。甜叶菊经提取糖苷有效物质后的残渣极小部 分被用来饲养动物,而绝大部分常被作为工业废料所废弃 [19],由于其仍含有极高的钙、铁、钾、磷等各种微量元素 [20]。长期实验表明,利用有机物进行施肥可以促进作物的生长,提高作物的质量 [21,22],因此甜叶菊残渣是一种能够改良土壤培肥植株土壤的很好的天然有机肥。 郭伟等人 [23]通过烟草专用肥料和施用甜叶菊残渣肥的试验,对比其对烤烟生长的作用,研究显示,优质烤烟生产更加依赖甜叶菊残渣制成的有机肥料,而且还能改善田间烟草植株的农艺的性状。其中有利中上等烟草的比例提高和产量增加,烟叶的外观和评级分析较常规种植效 果更好。徐江兵等人 [24]将甜叶菊残渣重新返回原种植甜叶菊的大田中,通过检测土壤中微生物种群的变化得出,甜叶菊残渣改变了土壤中微生物群落数量,尤其是增加了土壤中功能性微生物群落,进而对植株的生长发育起到了促进作用。 甜叶菊残渣除了能作为有机肥料,而且是一种极具开发价值的饲料原料。因万方数据上海海洋大学硕士学位论文 3 为其粗蛋白含量较高,其中氨基酸的种类多达 18 种,还有粗脂肪、粗纤维、粗灰分、无氮浸出物等大量非糖营养成分,另外富含 VB1、 VB2、 VC 等多种维生素物质。孙艳宾等人 [25]研究了甜叶菊残渣在饲料里的适当添加对肉兔生长性能、主要养分的 转化率以及器官相关指数的影响,试验结果表明,肉兔的免疫器官指数和免疫效果都有增强的趋势。王远孝等人 [26,27]的研究指出甜菊糖苷对断奶后仔猪的日摄食量、日体重增加量以及偏嗜指数都具有显著的促进作用,最主要的是通过改善仔猪肠道菌群降低了仔猪的腹泻指数,从而降低仔猪死亡率。 除此之外,还有研究表明甜叶菊及其提取物还具有抑菌 [28]等作用,因此它作为植物资源能够被有效开发出多种不同类型的产品。本研究所用到的维科生物制剂液剂就是以甜菊糖苷残渣等为原料通过微生物发酵生产制成的。由于甜菊糖苷残渣中粗纤维的成分较高,而 利用微生物对其发酵后,可以有效降低其粗纤维的含量,而且还能提高总蛋白含量,同时还产生了维生素类物质以及一些功能性酶类物质如消化酶。通过大量的试验研究,并结合实际的生产应用,证实了发酵性饲料能够有效地增加禽畜对饲料的利用转化率、改善禽畜的生产性能、提高抗病能力、减少死亡率等优点 [29-31]。 因此,维科生物制剂这种利用废弃植物综合利用生产的天然制剂对改善农、畜、禽类品质具有积极的作用,在很大程度上还能缓解环境的污染,如何促进其更深入地发展和利用将是一项崭新的研究,具有非常广阔的前景。 万方数据上海海洋大学硕士学位论文 4 第二章 甜叶菊残渣抗氧化活性物质的超声辅助水浴提取工艺的响应面优化 2.1 材料与方法 2.1.1 实验试剂 甜叶菊残渣系选自生产糖苷后的残渣物质,分为样品 A, 100甜叶菊杆茎粉末;样品 B, 100甜叶菊叶子粉末;样品 C, 80甜叶菊杆茎和 20甜叶菊叶子混合粉末。 由日本维科生物制剂株式会社提供。 1-二苯基 -2-苦基肼 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH,纯度≥ 85 德国Fluka 公司; 无水乙醇 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司。 2.1.2 仪器与设 备 ALC-210.4 电子分析天平 上海精密仪器仪表有限公司 ; HSS-11-6 电热恒温水浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司; KQ-700B 型超声波清洗仪 江苏省昆山市超声仪器有限公司 ; 80-5 微电脑 离心机 江苏国华电器有限公司; UV-3000PC 型紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。 2.1.3 实验方法 2.1.3.1 甜叶菊残渣生物活性物质的提取 准确称取 2.00g 的 三种甜叶菊残渣 粉末 样品 若干份于锥形瓶中,分别在不同的料液比、水浴提取时间、水浴提取温度下进行提取,水浴操作后在 53kHz 的超声波清洗 仪中继续进行超声辅助浸提 , 并同时室温静置浸提相同时间,将浸提完成的样品提取液全部转入离心管,以 3500r/min 离心 10min 后取上层清液,测定提取液的 DPPH 自由基清除率。考察料液比、水浴提取时间、水浴提取温度和超声辅助提取时间对 DPPH 自由基清除率的影响,单因素 实验 因素及水平见表 2-1。 表 2-1 单因素实验因素与水平 Table 2-1 Factors and the level of the single-factor test 万方数据上海海洋大学硕士学位论文 5 水平 料液比 g/mL 水浴时间( min) 水浴温度 ?C 超声辅助时间( min) 1 15 20 30 0 2 110 40 40 5 3 115 60 60 10 4 120 80 80 15 5 130 100 100 20 6 140 120 25 2.1.3.2 甜叶菊残渣生物活性物质清除 DPPH 自由基能力的测定 1-二苯基 -2-苦基肼 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH是一种很稳定的有机自由基 [32],在乙醇溶液中呈现深紫色,在 517nm 波长处有最大吸收峰。 当其溶液中加入抗氧化剂时, DPPH 自由基的单电子被结合或替代,使 DPPH自由基数量减少而使其溶液颜色逐渐变浅,在最大吸收波长处的吸光度减小至稳定。吸光值减小的程度与清除剂的清除能力及其数量呈定量关系,因此,通过在517nm 波长处检测提取的甜叶菊残渣生物活性物质 DPPH 自由基的清除效果,计算其抗氧化能力 [33]。通过 DPPH 法可以简便、快捷地对自由基清除剂进行筛选 [34]。 准确称 取 DPPH 0.0197g,用无水乙醇溶解,定量转入 250mL 棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度线,摇匀后得到浓度为 0.2mmol/L 的 DPPH 溶液,现配现用,避光冷藏保存。 参考文献 [35-37],取 2 10 - 4 mol/ L DPPH 溶液 3mL 与等体积甜叶菊残渣提取液混合后摇匀,室温放置 30 min,用无水乙醇作为校准液,在 517 nm 处测定混合溶液的吸光值 Ai,同时测定 3 mL 2 10 - 4 mol/ L DPPH 溶液加入 3 mL 无水乙醇混合液的吸光值 A0,再测定 3 mL 样品液与 3 mL 无水乙醇混合液的吸光值 Aj,计算 DPPH 的自由基清除率,从而评价抗氧化能力,清除率值越高,抗氧化能力越强。 DPPH 的自由基清除率计算式 2.1.3.3 数据分析 根据单因素 实验 所得的结果,选取其中较佳条件,利用 Design Expert 7.0 软件进行工艺参数的优化组合,采用 Box-Behnken 响应面分析得到回归模型和优化的万方数据
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