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河 南 省 科 技 攻 关 计 划 项 目申 请 书姓 名 Luo Binjie 项目名称 miRNA 与膀胱癌诊断,临床治疗的相关研究 单 位 郑州大学 联系电话 填 报 说 明请根据自己的专业及研究方向,针对某具体临床问题,结合所学习临床科研方法的一种或几种写出一份科研设计。完成后,文件以个人姓名命名,发至1736601711qq.com。考核成绩依设计书优略评定。截至日期 2013 年 11 月 8 日。一、项目的立项依据和意义(说明国内外相关领域技术发展水平和趋势等)1全国肿瘤登记地区膀胱癌发病率为 7.49/10 万,世界人口标化发病率(世标率)为 4.53/10 万,膀胱癌居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第 1 位, 居中国恶性肿瘤发病率第 8 位,居中国男性恶性肿瘤发病率第 6 位 ,全国肿瘤登记人口膀胱癌发病率,呈现逐年增长趋势[1] 。孙思邈千金要方·卷一·诊候“古之善为医者,上医医未病之病,中医医欲病之病,下医医已病之病。在医学如此高速发展的今天,我们显然不会满足大多数“发现无痛性肉眼血尿--进行膀胱镜检--再行手术切除膀胱灌注”的这一套最常见的膀胱癌诊治流程。介入科韩新巍教授说过未来医学是微创和介入医学的为主导的,内外科为辅助的医学。显然对 miRNA 的探求能对膀胱癌的诊治带来前所未有的契机。微小核糖核酸(microRNA ,miRNA)在转录后水平对基因的表达进行调控。miRNA 在膀胱癌的演进过程中发挥着类似于癌基因或抑癌基因的作用。目前研究表明,对 miRNA 的调控可为临床膀胱癌的诊治提供一个新的靶点,提高膀胱癌患者的远期生存率和生活质量[2] 。1关于miRNA miRNAs 是一类大小为19个~25个碱基的单小分子RNA。在细胞核内,它本身不编码蛋白,但是可调节其他基因的翻译表达。miRNA 初级产物在RNA 聚合酶Ⅱ 作用下合成miRNA 转录前体(Pri‐miRNA) ,然后经RNA 聚合酶Ⅲ (Drosha 酶)和DGCR8 蛋白加工后,形成发卡环结构的miRNA 前体(Precursor miRNA ,premiRNA),最终被转运体Exportin5 转运至细胞质,由核酸酶Dicer 剪切形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA‐induced silencing complex ,RISC)。miRNA 通过与靶mRNA 特异碱基配对而引起靶miRNA 的降解或翻译抑制,在转录后水平调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的增殖和凋亡 。细胞可分泌含miRNA 的复合物进入体液,如尿液、血液、唾液、母乳 。一种miRNA可靶向一个或者多个mRNA ,多种miRNA 也可同时靶向一个mRNA。因此,异常表达的miRNA 不仅能致癌而且有肿瘤抑制的功能。2miRNA与膀胱癌的关系的研究趋势及范围表 1部分膀胱癌相关miRNAs 的差异表达(数据来源于 miRNAs 在膀胱癌诊治中的研究进展 )miRNA miRNA 表达变化 推测靶基因 miRNA-19a 上调 PTEN miRNA-222 上调 miRNA‐99a /100 下调 FOXA1 miRNA‐1 下调 IncRNA UCA1 miRNA‐24‐1 下调 FOXM1 miRNA‐145 下调 PAK1 miRNA‐101 下调 miRNA‐126 下调 ADAM9 miRNA‐125b 下调 SIRT7,MALAT12表 2miRNA 表达水平变化与膀胱尿路上皮癌的关系[3 ]3表 3miRNA 家族的一些机制细分43.国内外相关研究成果ImiRNA 与膀胱癌早期诊断的一些研究发现Tolle 等在血液中和尿液中不同表达的miRNAs 来发现膀胱癌,采用数据库来源于the Sanger database v14 的基因芯片分析,在血液中,miRNA‐26b‐5p 、miRNA‐144‐5p 、miRNA‐374‐5p 在浸润性膀胱癌中高表达,而且miRNA‐26b‐5p 特异度为94% ,敏感度为65% 。在尿液中miRNA‐618 、miRNA‐1255b‐5p 在浸润性膀胱癌中高表达,而且miRNA‐1255b‐5p 特异度为68% ,敏感度为85% 。由此推断,根据血液、尿液中一些特异的miRNAs 来诊断浸润性膀胱癌成为一种可能[4]。Zhang等检测97 例膀胱癌患者手术标本的癌组织和邻近正常组织miRNA‐222 表达水平,分析它们与临床病理参数和预后评估相关性。结果显示肿瘤组织miRNA‐222 的表达水平显著高于相应的非癌组织( P <0 .000 1) 。Kaplan‐Meier 分析表明,具有较高miR‐222表达水平的患者与低表达水平患者相比较,5 年生存率分别为29 .53% 和52 .75% 。其中包括miRNA‐222 过表达,肿瘤病理分级,肿瘤分期和肿瘤数目的多变量Cox 回归分析,miRNA‐222 的过表达与较差存活率独立相关(HR6 .17 ,95% CI 2 .33 ~ 10 .39 ,P < 0 .001 ) 。miRNA‐222 的过表达提示膀胱癌预后不良,并且可以被用来作为警示预后不良的生物标志物[5]。Feng 等利用Taqman 探针茎- 环法PCR 精确测量100 对患者的膀胱癌组织、相邻的非肿瘤组织、膀胱癌患者和正常人对照的血浆miRNA‐19a 水平。用miRNA‐19a 模拟和抑制剂转染膀胱癌细胞。结果发现miRNA‐19a 在膀胱癌组织中显著上调,而且miRNA‐19a 的表达水平与癌细胞的侵袭能力相对应。同时,获得或丢失miRNA‐19a 的功能性试验印证了它可能在膀胱癌的发展中起癌基因作用。此外,膀胱癌患者的血浆中检出的miRNA‐19a 支持发展为膀胱癌的潜在诊断标记物。另一组研究者利用互补的反义核酸转染到原先上调的miRNAs,发现其表达明显受到抑制,并检测出肿瘤细胞增殖明显减缓[6]。Zhu 等通过小干扰RNA(siRNA)和miRNA‐145 介导的IGF‐IR 的敲除实验揭示了miRNA‐145 促进癌细胞凋亡,进一步分析发现主要通过影响的IGF‐IR 信号传导,以抑制IGF‐IR 的表达,抑制癌细胞增殖和迁移,起到抑癌基因的作用。另一组研究者发现膀胱癌中miRNA‐34a 、miRNA‐100 、miRNA‐149 、miRNA‐340 均体现为抑癌基因的作用。他们采用转染的方式上调其表达,发现癌细胞增殖、分化能力明显受抑制,而且侵袭、迁移能力也减弱,印证了它抑癌基因作用的推测[7].(检测出来了说明对于膀胱癌患者是好的)5IImiRNA 与膀胱癌的治疗Li 等研究发现,以顺铂为基础的化疗诱导了 miRNA‐34a 的启动子去甲基化,增加 miRNA‐34a 的表达,反过来增强了肌层侵入性膀胱癌细胞对顺铂的敏感性,降低了癌细胞侵袭性和增殖能力[8] 。Kozinn 等根据 miRNAs 的变化来预测是否对吉西他滨有抵抗性,研究结果提示 miRNA‐1290 、miRNA‐138 、miRNA‐let‐7i 、miRNA‐let‐7b 通过调节黏蛋白4 ,使吉西他滨产生耐药性。由此设想,通过调控的特定 miRNAs 的表达或者影响其上游基因信息传递通路,可以增强膀胱癌化疗的敏感性以及减少其耐药性[9] 。把表达 p53 基因的腺病毒载体和靶向于 CDKN1A 基因的人工 miRNA 转染进入癌细胞可增加癌细胞对阿霉素的化疗敏感性;miRNA‐521 的表达增加可通过靶向 DNA 修复酶位点增强肿瘤细胞在辐射中的敏感性[10].为解决临床膀胱癌患者对顺铂耐药的问题,Drayton 等研究发现SLC7A11 基因的表达与 miRNA‐27a 的表达呈负相关,当 miRNA‐27a 高表达或者通过 siRNA、柳氮磺胺吡啶降低 SLC7A11 基因的活性时,耐药的膀胱癌细胞株的致敏性得以恢复,由此可推测 miRNA‐27a 可作为治疗膀胱癌患者对顺铂耐药的一条途径[11] 。4选取自己感兴趣的 mi-RNA 家族成员进行研究相关研究表明 mi-RNA99a 作为一个肿瘤抑制因子,在膀胱癌中水平降低,有降低尿路上皮癌侵袭性可能。其他相关研究mi-RNA 在人类可以通过靶基因mTOR 促进食管鳞状细胞的凋亡[12] ,mi-RNA 的低表达也能促进口腔鳞癌细胞的增殖[13] 。那么它的高表达是否意味着膀胱癌患者癌细胞同样受到抑制,提示着患者预后较好或者依据 miRNAs 表达的时序性和组织特异性特征,可以探索膀胱癌各个发展阶段中的特定 miRNA 表达谱,用于判断膀胱癌恶性程度和临床分期或者是提前通过测量其相关调控基因产物预测患者患膀胱肿瘤风险或者是了解它的表达是否能增强治疗膀胱肿瘤药物的敏感性及耐药性等我选取一个比较小的研究点研究可以反其道而行之,根据临床上已经确诊的膀胱癌的标本或者细胞株来测量 mi-RNA 的含量,同时测量一定标本正常人群 mi-RNA 的含量,来推测膀胱尿路上皮癌各个发展阶段中的特定 miRNA 表达谱是否与膀胱癌恶性程度和临床分期存在着某些统计学上的联系。[1]韩苏军, 张思维,陈万青,李长岭。中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析。中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所,泌尿外科。6[2]梁敏,王海峰,王剑松。 miRNAs 在膀胱癌诊治中的研究进展 。医学与哲学 2015 年 6 月第 36 卷第 6B 期总第527 期。[3]孙阳综述,郭剑明审校.miRNA 调控与膀胱癌的关系研究进展 。International Journal of Urology and Nephmlogy。Jan 201 1.V01.31 NO.I[4]Tolle A ,Jung M ,Rabenhorst S ,et al .Identification of microRNAs in blood and urine as tumour markers for the detection of urinary bladder cancer[J] .Oncol Rep ,2013 ,30(4) 1949 - 1956 .[5]Zhang D Q ,Zhou C K ,Jiang X W ,et al .Increased expression of miRNA‐222 is associated with poor prognosis in bladder cancer [J] .World J Surg Oncol ,2014 ,12 241 .[6]张 明,魏 巍,刘禄成,等.反义微小RNA‐21对人膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响[J] .吉林大学学报医学版,2010 ,36(3)450 - 452 .[7]张 超,姚志勇,朱鸣阳,等.microRNA‐34a 通过 Notch1 对膀胱肿瘤细胞株 T24 增殖的影响[J] .解放军医学杂志,2012 ,37(5) 426 - 430 .[8]Li H ,Yu G ,Shi R ,et al .Cisplatin‐induced epigenetic activation of miR‐34 a sensitizes bladder cancer cells to chemotherapy [J] .Mol Cancer ,2014 ,13(1) 8 .[9]Kozinn S I ,Harty N J , Delong J M ,et al .MicroRNA Profile to Predict Gemictabine Resistance in Bladder Carcinoma Cell Line [J] .Genes Cancer ,2013 ,4(1 /2) 61 -69 .[10]Josson S ,Sung S Y , Lao K ,et al .Radiation modulation of microRNA in prostate cancer cell lines[J] .Prostate ,2008 ,68(15) 1599 - 1606 .[11]Drayton R M ,Dudziec E ,Peter S ,et al .Reduced Expression of miRNA‐27 a Modulates Cisplatin Resistance in Bladder Cancer by Targeting the Cystine/Glutamate Exchanger SLC7A11[J] .Clin Cancer Res ,2014 ,20(7) 1900- 2000[12]Sun J, Chen Z, Tan X, Zhou F, Tan F, Gao Y, Sun N, Xu X, Shao K, He JMicroRNA-99a/100 promotes apoptosis by targeting mTOR in human esophageal squamous cell carcinoma. Med Oncol 2013, 30411.[13]Yan B, Fu Q, Lai L, Tao X, Fei Y, Shen J, Chen Z, Wang Q Downregulation of microRNA 99a in oral squamous cell carcinomas contributes to the growth and survival of oral cancer cells. Mol Med Rep 2012, 6675–681.二、项目创新点、主要研究开发内容及目标(实施方案、技术关键、技术路线和技术经济指标等)7实施方案通过实验测量膀胱癌标本不同临床分期,病理分期 mi-RNA 含量,同时测量一定标本正常人群 mi-RNA 的含量,来推测膀胱尿路上皮癌各个发展阶段中的特定 miRNA 表达谱是否与膀胱癌恶性程度和临床分期存在着某些统计学上的联系。1技术经济指标哺乳动物血清中循环核酸表达水平稳定,检测的可重复性良好,具有作为肿瘤标志物的潜力[1] 。尿液、粪便甚至毛发,也是临床上易于获得的检测样本。如果能找到相应的miRNAs 表达谱,又具有较高的敏感性和特异性,来作为膀胱癌诊断的生物标记物,替代目前的有创性检查,将是巨大的突破。最终我们希望通过大量实验证实可以依据 miRNAs 表达的时序性和组织特异性特征,探索膀胱癌各个发展阶段中的特定 miRNA 表达谱,用于判断膀胱癌恶性程度和临床分期,从而为诊治提供依据。2技术路线 i选取实验对象选取我院住院患者中 40 例(便于统计学检验)正常膀胱粘膜上皮组织(可取材于成人尿道下裂手术) ,选取 50 例已经确诊为膀胱癌患者的手术标本(可非浸润性 I,II,III 级各 10 例,浸润性标本 20 例,需由病理科配合完成) 。沟通患者签署研究知情同意书,研究方案交医院伦理委员会批准。ii组织总 RNA 的提取及质量检测从上述组织标本中取 50 ~100 mg 组织块以提取总RNA,组织块在液氮中研磨成粉末状后倒入匀浆器中,加 1 ml TRIzol (TRIZOL 是一种新型总 RNA 抽提试剂)处理,然后倒入 Ep 管中,12 000 r /min,4℃离心 20 min 后取上清,按照 Invitrogen 公司的 TRIzol 使用说明书提取总 RNA。甲醛变性胶电泳检测总 RNA 质量.iii逆转录 cDNA 合成,定量 PCR 采用 50 μl 反应体系5 μl 模板 逆转录产物,4 μl 引物混合物10 pmol /μl,25 μl 2 SYBR Green,16 μl 水。反应条件95℃ 15 min;95℃ 15 s,56℃ 20 s,68℃ 20 s,扩增 40 个循环;95℃ 1 min,56℃ 1 min,95℃ 1 min,采集熔解曲线.iv实时定量反转录聚合酶链反应RTqPCR检测 miRNA-99a 的相对表达量vi基因表达水平计算以2‐ △ CT (△ CT = 标本目的基因 CT 值‐标本内参基因 CT 值)表示样本中目的基因的相对表达量,△ CT 越高,表达量越低。vii统计学处理 用 SPSS 软件对数据进行统计,对其肿瘤组织中 mi-RNA99a 表达量(Ct值)进行独立样本的 t 检验。相关性采用 Spearman 相关分析。对肿瘤恶性程度(G1-G2 和G3,肿瘤的临床分期(I-II 和 III-IV分组不同的无进展生存期差异,进行 log-rank 检验,并分别采用 Kaplan-Meier 方法绘制生存曲线;多因素分析釆用 Cox 比例风险回归模型进行分析。将单因素分析中有统计学意义的临床病理因素临床分期、mi-RNA99a 表达量纳入Cox 比例风险回归模型进行综合分析,变量筛选采用逐步向前回归法,以 PS 0. 05 为纳入标准,P0. 10 为剔除标准。可简单绘制如下统计表格RTqPCR 检测膀胱上皮癌和正常膀胱上皮组织中差异 mi-RNA99a 基因的表达(x ±s)标本分组 标本数 mi-RNA99a基因的表达检测值 正常 20分级 I级 10II级 10III级 10分型浸润性 20 非浸润性 30 [1]李先承,李秀男,宋希双.MicroRNA‐21 与实体肿瘤关系的研究进展[J] .大连医科大学学报,2012 ,34(2) 182 - 188 .8三、实施本项目已具备的条件(说明已具备的试验手段、技术力量、前期科研基础情况)91检测 miRNA 的方法目前已经开发出多种 miRNAs 的表达检测手段,如Northem blotting 、实时定量 PCR (RT-PCR) 、基因芯片技术等。Northem blotting 是基于分子杂交的检测技术,它是最先运用于 miRNAs 的半定量检测,视作该检测的金标准[1] 。RT PCR 是现今 miRNAs 应用得最广泛的定量检测方法,其中常用的有 polyA 聚合酶加尾法和茎环法(stemloop) [2] 。通过对比这两类基于 PCR 技术的 miRNAs 定量检测方法的基本原理和试验流程,比较了它们技术间的异同,认为茎环引物法能够检测到10pg miRNAs,而加尾法能检测到25pg 的 miRNAs ,前者的灵敏性更高。基因芯片技术(DNA microarray) ,其工作原理也是通过分子杂交进行定性与定量分析。但是基因芯片可以一次性分析数万个基因,进行 miRNAs 高通量筛选和分析。并可以经实时定量基因扩增荧光检测系统(QRPCR)验证膀胱癌组织差异表达的 miRNAs。最近,也有研究者运用荧光DNA 探针技术来分析成熟 miRNAs[3] 。现今 miRNA 调控与膀胱癌的关系研究着眼于表达谱研究miRNA profile及功能性实验(functional experiment。表达谱研究指已知正常组织细胞中表达的特定多个 miRNA,比较相关肿瘤组织 如膀胱内正常尿路上皮对应尿路上皮癌组织内这些 miRNA 表达水平的变化[ 4] 。功能性实验旨在确定某些 miRNA 是否调控已知原癌或者抑癌基因的表达,即确定 miRNA 调控的靶点[ 5] 。2 科研技术力量郑州大学河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室为河南省级医学研究实力较强的科研机构,成立以来每年可支配大量科研经费,拥有许多具有硕士或博士学位的专业技术人员和完成该实验所需的大型仪器。统计处理方案方面可以请教公共卫生学院的各位资深统计学者作指导。医学院研究方面与一附院合作紧密。通过病理科资深专家和泌尿外科手术室的协助,可谓是如虎添翼。3前期科研基础人员资深病理学家对膀胱癌患者标本的采集,专业从事 mi-RNA 基础研究的基础医学院学者,专业的公共卫生学院的统计学者,娴熟泌尿外科手术专家财政可以申请专门的实验经费来完成这个项目,国家自然基金,青年基金,学校科研部门经费的支持等。硬件环境专业的现代化分子研究实验室,各种现代化研究大型仪器已完成科研成果相关专家对于 mi-RNA 家族其它部分成员有深刻的研究,对于试验中发现的新的生化指标应用于临床诊治有着一套熟悉的流程,科学的推断,严谨的论证。这些资料可以通过文献获得。、[1 ] Cissell K A ,Deo S K .Trends in microRNA detection[J] .Anal Bioanal Chem ,2009, 394(4)1109 - 1016[2 ]陈新,曾长英,卢 诚,等.基于 PCR 技术的 miRNA 定量检测方法[J ] 。中国生物工程杂志,2010 , 30(11) 88-93 .[3 ] Kato Y .An efficient fluorescent for selectivedetection of mature miRNA species[J] .Nucleic Acids SympSer (Oxf) ,2008,52 (1) 71-72.[4 ] Volinia S, Calin GA.Liu CG。el a1.A microRNA expression siguature of human solid tumors denes cancer gene targets.Proc Nail Acad Sci USA。2006。1032257 226I.[5 ] Lindow M.Gorodkin J.Principles and limitations of computationalmicroRNA gene and targetnding.DNA Cell Biol。2007。26339351.
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